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究極の 削除/引用 No.1159-7 - 2008/01/26 (土) 05:16:14 - CaP 同調を得るために、わざわざクローニングする、というのを聞いたことがあります。 いずれにせよ、完全に同調するのは難しいですから、どこまで妥協してどういう解釈をするか、でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1159-6 - 2008/01/25 (金) 15:01:03 - ~ 試薬の濃度や変更以外の部分で気になった点として、 細胞は起こしてから3回継代したものという意味でしょうか？ 早すぎて、ストックのダメージからまだ立ち直っていないということはありませんでしょうか。 Double-thymidine blockである必要はあるのでしょうか。 新生化学実験法18　細胞培養技術ではHeLa S3の場合、 過剰チミジン(24時間)、増殖培養液(10時間)、ヒドロキシ尿素(14時間)で、 2回同調する方法が書かれています。(濃度は書かれていないようです) 試薬を使った同調の場合、試薬による影響が問われるでしょうから、2種類くらいの同調法でのデータがあったほうがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1159-5 - 2007/11/07 (水) 20:06:39 - Y Aphidicolinを使うと目的とするタンパク質によっては、正常状態を反映しない 可能性があるので注意が必要かと思います。 この薬剤は少しS期に入った状態で同調されるということもあるので、そこも 気をつけたほうがいいです。 チミジン除去後に細胞周期が思ったようにまわらないのは大変ですね。単純な話ですが、除去する培養液などが暖まっていない、状態が悪い（CO2インキュベーターに通しておいたほうが、その後の立ち上がりはよいです）などで、その後の挙動が変わったりします。HeLaは増殖がいい細胞なので、あまり気にしないでいいのかもしれませんが。。

(無題) 削除/引用 No.1159-4 - 2007/10/26 (金) 10:18:18 - Gira 細胞密度と細胞の感染（マイクプラズマ）などはだいじょうぶですか？ HeLaなので密度もある程度は問題ないと思いますが。 growthがわるければ、なにしたって同調は出来ませんので、FBSのロットなども含めて元気に増殖しているかを確認してください。 あとHeLaは他の細胞とthymidineの量が少し違っていたように思いますが、文献などを参考になれてますか？ M期進行が遅いと言うことから、増殖に問題があるか薬剤の濃度が高すぎるのではないかという印象をもちました。

別の方法ではいかがでしょうか 削除/引用 No.1159-3 - 2007/10/25 (木) 14:34:50 - M １）１回目のblock後のリリース時間は適正ですか？私は12〜14時間程度リリースしてから２回目のblockを行ないます。 ２）M期やG1期がみたいということでしたら、nocodazoleで12〜16時間程同調させて、同調細胞（M期）のみshake offしてPBSでwash後、リリースする（数時間後、G1期に）方法もあります。細胞にもよりますがHeLaなら問題なく同調できると思います。 ３）M期であまり長時間arrestしたくなければ、nocodazole→shake off→thymidineという処理をしている論文もよく見ます。shaken offされた細胞はほぼ全てがM期の細胞なので、その後のthymidineでの同調細胞も高い確率で得られるようです。 ４）又はthymidineの代わりにaphidicolineを用いるという方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.1159-2 - 2005/07/07 (木) 09:35:33 - 返信 Cell:A laboratory Manual(Cold spring harbor Laboratory press, 1998)という3分冊の本のなかの、ダブルサイミジンブロックの項で、欄外の小さい字で書かれた補足説明のような形で、この問題の解決の一助になるような記載をみた記憶があります。この本は今はもう持っていないので記述があいまいで申し訳ありません。）2回目のサイミジンを除いても停止していたG1/Sのボーダーから各細胞が均一かつ速やかに細胞周期に入りにくい場合があるので、その場合はスムーズに細胞周期に乗せるため、何かの試薬（たしかヌクレオチドのようなもの）を使うみたいな事が書いてあったと記憶しています。細胞生物学の研究者の人には広く使われる本らしいので、もしも図書館や関連する研究室等にあれば確認してみてください。この本のことはシグマのカタログの2176ページにもで出ます。記憶を辿りながらなので、明確でなくて本当にすみません。

HelaのDouble-thymidine blockに関して 削除/引用 No.1159-1 - 2005/06/06 (月) 18:58:09 - びりびり 細胞周期によって目的とするタンパク質がリン酸化されているかどうかを調べたいと思っています。 そのために，Hela細胞をDouble-thymidine block法を用いてS期に同調させ，その後thymidineを除くことによってM期，G1期の細胞を回収できるような系を立ち上げようとしていますが，なかなかうまくいきません。 S期への同調があまりされず，thymidineを除いたあと8時間ほどでM期に移行するといわれているのに対し，私たちの系では12時間たっても半分くらいしかM期に移行しません。 細胞は３回しか継代していないものを使用し，thymidineも不純物の少ないものを使用しています。 ほかになにを注意したらいいのか・・・,途方にくれています。 細胞濃度や，thymidineの濃度を検討したほうがいいのでしょうか。 なにか，知っている方がいたら教えていただけないでしょうか。

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