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(無題) 削除/引用 No.1245-8 - 2008/04/23 (水) 11:17:52 - すもう 私もSUMOの研究をしております。このようなサイトがあり、ちょっと嬉しいような＾＾ in vitroでバンドが消失しなかったという件についてですが、KやRのクラスターであることが多いNLSに変異が入り核移行が行われなかったために、細胞内での修飾が行われなくなったという経験があります。KRmut.くらいではあまり変わらないものもあると思いますが、ものによってはと言う気がします。 もう一つ、tagへの修飾という件についてですが、私も考えたことがあります。そのときは、tagと遺伝子のリンカー部位にPreScissionプロテアーゼの配列を導入し、IPした後に切ってみました。一応、tagのみが切断されたようだったので、このときは一安心でした。tagはラボによっては、２ｘ、３ｘのリピートを使うようです（うちのラボも）が、１ｘの場合では、修飾された状態のtagを抗体が認識するとは考えにくいような・・・。

ついでに教えて下さい。 削除/引用 No.1245-7 - 2008/01/13 (日) 00:47:17 - freeのSUMO-1？ 抗SUMO-1抗体でWBをするとSUMO-1-RanGAP1のバンドが見えても、freeのSUMO-1のシグナルははほとんど見えないと聞いていていままでそう思っていました。でも最近の抗体のカタログの写真をみると抗体によってはきちんとfreeのSUMO-1も検出しているものがあります。（してない抗体の方が多いですが）これはなぜでしょうか。どっちが本当なのでしょうか。

試してみようと思います 削除/引用 No.1245-6 - 2005/09/28 (水) 18:16:48 - SUMO 名無しさん、あかねさんありがとうございます。 NEMに関しては知りませんでした。 さっそく試してみようと思います。 抗体に関してはZymedでいこうと思うのですが、Santaの抗体でクローン名がわかれば教えていただきたいと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1245-5 - 2005/09/28 (水) 13:31:04 - あかね SUMO化修飾を研究室で取り扱っています。 私自身はやっていませんが、参考になるであろう論文を紹介します。 JBC.278.50833 確かSUMO抗体はsantaの製品を使っています。 また、SUMO化サイトを同定するのはなかなか難しいです。 他のトピックスでもあったように、本来SUMO化されるKを潰しても、別のKにSUMOが入っちゃうことがあります（in vitro, 細胞を使ったIPでも同様）。これはSUMO化されるタンパク質の性質によるようで、KRmtでバシッとSUMO化サイトが決まる場合もあります。ひどい話では、ターゲットにtagを付けて解析していたら、tagのKにSUMOが入ったなんて経験もあったようです。 また、SUMO化の修飾を見るのにはSUMOを強制発現させないとなかなか難しいと思います。うちではSUMOやE1,E2,E3等の組み合わせを強制発現させてから実験をおこなっているようです。 また、IP等でSUMO化修飾を見るにはlysisi bufferにNEMを入れるのがコツだと言っていました。

(無題) 削除/引用 No.1245-4 - 2005/09/27 (火) 09:18:38 - 名無し １）抗体と検出感度の事。 抗体に関しては前に書いた以上の情報はもっておらず、すもません。ただおはなしから推察すると、目的蛋白質全分子のうち実際にスモ化されている割合は、調べられた細胞では非常に僅かなように感じます。調べた細胞は定常状態のものでしょうか。ご存知のように、蛋白質によっては、スモ化はDNAダメージ、ストレス、細胞周期など細胞内外のさまざまな変化、刺激に応答して極めて動的に変化する場合があります。あなたの蛋白質の機能から考えてそのあたりはどうでしょうか。ある刺激、状態の時だけスモ化あるは脱スモ化される可能性を考えて、実験をデザインしてみたら、何か新しいことがみえるかもしれません。またこれは下記のin vitroとin vivoの結果の違いにも関係してくるように思います。あとスモー２・−３も一度調べて見ることを薦めます。 ２）「実際には細胞内ではSUMOはくっつかないリジンに非特異的にくっついてしまっているのではと、考えているのですが・・。」について。 そういう可能性はあり得ると思います。in vitroの翻訳系で作った蛋白質が、細胞内のそれと必ずしも同一の高次構造をとっているかどうか実際にはわからないと思います。一方、スモの基質認識は､コンセンサス配列だけでなく、分子内の位置（スモ化酵素群がアクセスしやすいかどうか）、基質特異的なスモE3リガーゼの関与など複数のファクターで総合的に決まると思われます。（コンセンサス配列を持ちながら、実際にはスモ化されない蛋白質も少なくないことや、PCNA？のようにコンセンサス配列でないリジン残基が修飾されるケースからも分かるように）ゆえに、限られた特殊な条件下のin vitro系といちおう全部そろった天然に近いin vivo系ではスモ化のされ方に違いがあるのは不思議でないと思われますし、折角in vivoでポジティブな結果をえているのなら、そちらを大事にしたほうがよいのではないでしょうか。（普通は反対のケースで悩むことが多いのですが。）ただ他にコンセンサス配列があるならば一応、それらのリジンも置換してチェックしてみるのは必要かもしれません。あと、聞いた話ですが、スモを過剰発現したり、in vitro系で高濃度で使ったりした場合、（スモに限らず分子生物学実験一般でいえることですが）、特異性が甘くなり、本来スモ化されにくい部位がスモ化されることはありうるようです。ゆえに、内在性の蛋白質で、イムノプルダウン実験して示すのが、誰にも疑問の余地を与えないシンプルかつベストな方法と思います。

もう一つ教えてください。 削除/引用 No.1245-3 - 2005/09/26 (月) 18:42:13 - SUMO 情報ありがとうございます。 ＳＵＭＯ−１に対する抗体を使っています。 ターゲットの分子に対するＳＵＭＯ化の効率が悪いのか、ウエスタンでの検出時にＳＵＭＯ化されたターゲットが見えるくらい露光するとノンスペが高くなってしまって汚くなってしまうため感度のいい抗体があったらなと考えていたのですが。 ついでにもう一つ教えていただきたいのでおすが ＳＵＭＯ化タンパク中のターゲットのリジンを同定（２９３細胞へSUMOとターゲット分子を共発現させてKRミュータントでバンドシフトが消える）したのですが、In vitroでの反応（35Sを使ってin vitro 転写翻訳の系でリコンビナントのＳＵＭＯ１を結合させる方法）においてミュータントを使ってもバンドシフトが消えません。 in vivoとin vitroでこういった違いがでることはあるのでしょうか？ 実際には細胞内ではSUMOはくっつかないリジンに非特異的にくっついてしまっているのではと、考えているのですが・・。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1245-2 - 2005/09/23 (金) 11:48:48 - 名無し 抗体はスモ-1に対するものですかそれともスモ-2/-3ですか。ウエスタンブロットならば、ザイメッド社のはどちらもちゃんとしていてOKでした。全細胞抽出液の場合、スモー１抗体は普通の時間、フィルムを露光すると90Kのランギャップー１のシグナルしかみえませんが、露光時間を長くすれば他の高分子量の蛋白質のシグナルもだんだん見えてきました。また細胞の中のスモ-1のモノマーは量がすごい少ないっていうかほとんど無い）ので長く露光しないと（X線フィルムで１０分以上とか露光してから普通の方のECLで検出した）シグナルが見えないですが、それ以外は大丈夫でした。またこれらはいずれもスモー１の性質を反映しているもので、抗体が悪いのではありません。なおスモ-2/-3は通常の仕方で、分子量の大きいコンジュゲートもモノマーもバシッと見えました。他の会社のとか、もらったのとかも使いましたが、なんか全然変で、結局ザイメッドが一番いいなあとか思ってました。 ただ細胞の免疫染色への向き不向きには、抗体によって、まちまちのようです。聞いた話ですが、スモー１の抗体の場合、核膜の辺とかが強く染まるものと、核質がディフューズに染まるものとがあるようです。ザイメッドのやつは後者っぽい感じでした。教科書的には核膜の辺が強く染まるように思うので、その点では、いいのかなあ？という感じはちょっとしました。 それと、たぶんですが、スモのための特別なプロトコールなどないと思います。ただよくご存知のように、細胞の脱スモ化酵素群の活性はすごい強いので、非変性条件で抽出するときは、ネムとかヨードアセトアミドなどを高濃度で加えないと（実際には、入れてもある程度までは）、抽出中にスモが基質からどんどん外れてしまいます。でもあなたの場合は直接SDSで抽出しているので、その心配は特にないでしょう。 私の経験はかなり大昔の話なので新しい情報があればそちらを尊重してください。

抗SUMO抗体とプロトコールについて 削除/引用 No.1245-1 - 2005/07/04 (月) 16:30:41 - SUMO 現在SUMO化について実験しているのですが、どうやらあるタンパクがSUMO化されていそうで、その修飾サイトも確定できそうというところまできています。 そこで良いSUMOに対する抗体が欲しいと考えているのですが、今まで使った抗体（Zymed)のはあまり検出感度が良いと思えなく別の会社のものを試してみたいと考えいます。 CSTやSantaなどからも出てるみたいなのですが、もし検出感度良い抗体をご存知の方おられましたら教えてください。 あと、SUMO化タンパク検出のためのプロトコール（特にcell free（35Sを使うやつ）？の系）でお勧めがあったら教えてください。 今は1%SDSでlysisしてsonicationしてます。

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