全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

mRNAのチェック 削除/引用 No.1532-11 - 2007/11/26 (月) 16:37:34 - mRNA エビの臓器から完全長のmRNAが抽出されているかどうかの指標としてTotal RNAのクオリティをチェックするため1.5%アガロースゲルでエチジウムブロマイドを用いて電気泳動を行ったのですが、リボゾームRNAのバンドが1000bpくらいに一つしか見られません。 28Sまたは18Sのバンドは通常どのくらいのサイズにでてくるものなのですか？ また、100bp付近にバンドが見られるのですが、これは分解されたものなのでしょうか？ どなたかご存知でしたら教えてください。お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1532-10 - 2005/10/14 (金) 22:41:50 - みっしー >「RNaseが異常なほど強い」というお話をもっとよく聞くので、 こんなふうに考えてみてはどうでしょうか。まず、細胞には多かれ少なかれRNA分解活性があります。それはそういう活性が必要だからです。ですから、DNAだったら「ぼーっとしていても」とれるような方法ではRNAはとれません。ので、細胞の保存ー破砕ー抽出の過程でいかにRNA分解活性を押さえるか、という観点で、さまざまな手法やキットが工夫されてきたわけです。今となっては（３０年前はいろいろ大変でしたが）、既存の方法を使えば特に分解活性が高い膵臓や骨以外はあまり心配しなくても良質のものがとれます（とれるはずです）。 また、RNA分解酵素にいろいろある中で、RNaseAはオートクレーブでも失活しないので、そのために特別な処理が必要になり、このことがRNase伝説に輪をかけています。実際にはRNaseAの分子量が比較的小さいので、オートクレーブで一旦変性したものが再フォールドしやすい、ということのようです。それで、ガラス容器は乾熱滅菌、プラスチックはDEPC処理、といった処方せんとなっているわけです。 本当に神経質になりたいときには、使う試薬一つ一つにRNAラダーをいれ、３７度で１時間くらいインキュベートしたあと変性ゲルに流し、全ての試薬にRNA分解活性がないことを確認します。よほどのことがないかぎり、私もここまではやりませんが。一度、エタ沈用に小分けしておいたエタノールにRNA分解活性があって、この方法でそれを同定したことがありました。 ＞チェックだけならDNA用で構わない、と。 というか、DNA用のゲルでチェックして不可なら、手間も量もかかる変性ゲルでさらなるチェックをする意味がない、ということです。 ではでは。

あと 削除/引用 No.1532-9 - 2005/10/14 (金) 11:58:29 - 初 >>自分 間違いが 2 つありましたね。 ・RNAが無事なら「同じ濃さ」でなくて「同じ分子量（=濃さは28Sが18Sの二倍）」 ・ホルムアミドじゃなくてホルムアルデヒド 不慣れな証拠ですね…何度も失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.1532-8 - 2005/10/14 (金) 11:51:07 - 初 >>みっしー　さん 丁寧なご指導ありがとうございました！ なるほど…。変性ゲルの方が細かい情報がわかるんですね。 チェックだけならDNA用で構わない、と。 隣のレーンに半量アプライという案もすばらしいと思います。 そして上述の英語プロトコールの記述が何を意味しているかようやくわかりました。 「RNA実験はサンプルの量や目的によってどこまで神経質になるかが変わってくる」 というお話はよく聞くのですが、同時に 「RNaseが異常なほど強い」というお話をもっとよく聞くので、 極端な話 1 分子のRNaseのコンタミでも数分でサンプルが完全分解されてしまうような、 そんな恐怖幻想？を抱いています。 もっと慣れれば力のいれどころ／ぬきどころがわかるんでしょうね… どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1532-7 - 2005/10/13 (木) 23:29:56 - みっしー 初さん、RNA実験はサンプルの量や目的によってどこまで神経質になるかが変わってきます。 組織や細胞からとったRNAがインタクトかどうかは、まずはみどりさんのいわれるように、DNA用のシステムで泳動します。フォルムアルデヒドは使いません。２８Sと１８Sは細胞内に同じ分子数あり、２８Sは１８sの約２倍の分子量なので、２８Sのバンドの濃さは１８sの２倍になります。サンプル数がそれほど多くなければ、アプライ量を半分にしたものをとなりに流しておくと比較がしやすくなります。分解の影響はまず２８sからでますので、１８sと２８sの濃さが同じ、２８sのほうが薄い、というパターンになったら壊れている可能性があります。１８sだけしか出ないというサンプルもありました。泳動槽の取り扱いはみどりさんの書かれているとおりです。この段階ではあまり神経質になる必要はありません。エチブロはうちでは後染めに統一しています。さっさと流すのも大切です。一晩かけてのんびり流していると、泳動中に壊れたんちゃう？といわれたら反論できません。 で、このテストをパスしたサンプルについて、フォルムアルデヒドを使った変性ゲルでさらなるチェックをします。ニックが多少入る程度の低い程度のRNAの分解があるときには、DNA用のゲルではその差がほとんど見えないからです。変性すれば、そういう分子は本来の長さへと移動しますから、２８s、１８sに相当するバンドの減少として観察されます。

(無題) 削除/引用 No.1532-6 - 2005/10/13 (木) 05:08:53 - 初 >>みどり　さん 素早い回答ありがとうございました!! こちらからのお礼が遅れてごめんなさい。 大変実用的なプロトコールをありがとうございました。 うちはDNA泳動はほぼすべて先染めでやってしまっています。 これからRNAの品質チェックをする際、 ホルムアミド入りゲルを作るよりはよっぽどTAE/TBE後染めの方がラクなので 是非みどりさんの方法を採用させていただきたいと思います。 試してみてもし先染めでも大丈夫なようならご報告します （役に立たなさそうな気もしますが）。 「なるべくささっと」とか「2 回やってみる」とか気に入りました（笑）。 しかし、『ほんとは大丈夫なのに泳動のどこかで壊れる』って、 どこで壊れるんでしょうねぇ… ローディングダイと混ぜたとき？　ゲルにアプライしてから流すまでの間？ それとも電圧かけてゲル内を泳いでる最中？ もし心当たりがあったら聞かせていただけると幸いです。 とにかくありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1532-5 - 2005/10/11 (火) 11:24:48 - みどり 初さんへ お答えします。 (1) 簡易法としては通常のエチブロ入り TAE or TBE ゲルでの 　　泳動で構わないのでしょうか？ 　DNA用１％アガロースゲルを普通に電子レンジでチンして作っています。 　うちの研究室では全ての核酸電気泳動は、泳動後にエチブロ入り液に 　１０分くらい浸けます。 　エチブロ入りのゲルはよくないかもしれません。 (2) このとき、RNase によるサンプル分解を防ぐためにどの程度まで 　　気を使っていますか？ 　ゲルは上でいったように新調します。 　泳動槽は水道水で水洗する程度。 　なるべくささっとアプライして流す。 　壊れたパターンがみられたら、念のためもう一度やりなおす。 　（初心者がすると実際は壊れていないのに、どこでか壊れる 　　ことがある。２回ともだめだったら取り直し。） 　１マイクログラムぐらい流してみて、28S, 18Sが大体２対１くらいに 　きれいにみえれば、OKとしています。

便乗してお聞きします 削除/引用 No.1532-4 - 2005/10/11 (火) 04:07:23 - 初 便乗してお聞きします。 本来は別件でトピックを作るべきかもしれないのですが なにとぞお許しください。 >>みどり　さん 私も同様に Total RNA の品質チェックとしての 泳動を行いたいと思っています。 要するに「rRNA のバンドが 2 本同じ太さでくっきり見えたら、 きれいな Total RNA が取れたと判断する」という泳動です。 この場合、 (1) 簡易法としては通常のエチブロ入り TAE or TBE ゲルでの 泳動で構わないのでしょうか？ 英語のプロトコール本には「ホルムアミド入りのもので 確認することを強く勧めるけれども代替法としては いつものゲルでいい」というようなどっちつかずなことが 書いてありました・・・不安です。 (2) このとき、RNase によるサンプル分解を防ぐためにどの程度まで 気を使ってらっしゃいますか？ ・ゲルは新調、泳動槽はNaOH処理？ ・ゲルと泳動槽を水洗する程度？ ・特に無し？ 皆様どうぞご意見をください。 RNA実験は何をどこまで気を使ってよいのか、 初心者には精神的に疲れる実験ですね…

(無題) 削除/引用 No.1532-3 - 2005/10/06 (木) 12:03:08 - gene 何を見たいか、見るべきかによって違うと思います。 言うまでもなく、native gelなら、二本鎖は二本鎖のまま泳動されるのに対して、denatured gelなら一本鎖に解離した状態で泳動されます。 二本鎖が予想通りにできているか、二本鎖の純度はどうか（一本鎖のコンタミなど）を調べるならnativeでみなければわからないでしょう。kさんはわざわざdsRNAを作ろうとしたのですから、こちらのケースではないですか。

(無題) 削除/引用 No.1532-2 - 2005/10/06 (木) 11:40:55 - みどり 私はmRNAを抽出したとき、壊れていないかどうかのチェックに リボゾームRNAをみるためには、簡易的に DNAの電気泳動と同じTAEでおこなっています。 この目的には充分ですが、サイズの確認となると 正確かどうかはわかりません。 ノーザンをするときはホルムアルデヒド入りの ゲルを使います。このようにして使いわけています。

RNA サンプルの電気泳動 削除/引用 No.1532-1 - 2005/10/06 (木) 07:11:15 - k 約500bp 程度の dsRNA を作成しました。目的物ができているかどうか確認するためにアガロースゲル電気泳動を行い確認をしようと思います。 そこで教えて頂きたいのですが、RNA は通常の TAEアガロースゲルで泳動しても問題無いのでしょうか？RNA ラダーマーカー（Fermentas社のサンプル品です）の添付文書を見ると通常のアガロースゲル泳動像と 1%formaldehyde MOPSアガロースゲルの２種類の泳動例が載っていました。若干パターンが違うものの奇麗にいっています。ラボメンバーは後者を勧めています。ちなみに昔居たラボでは RNA の泳動は TAE では無く TBE (bolic acid) バッファーを使っていましたが、formaldehydeは使っていませんでした。これらの違いをご教授頂ければと思います。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---