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(無題) 削除/引用 No.1845-7 - 2007/10/13 (土) 15:29:59 - plasmid > 移動度の大きいバンド すみません。 逆でした。 プラスミドダイマーは、 移動度がオープンサーキュラー型よりも小さく、大腸菌由来のゲノムよりも大きい位置に検出されるバンドです。

(無題) 削除/引用 No.1845-6 - 2007/10/13 (土) 15:26:27 - plasmid それはおそらく『プラスミドダイマー』であると考えられます。 僕もあまり詳しい事はわかりませんが、 大腸菌の培養時のコンディションなどなど、 たまたまできてしまうと考えられます。

自分も経験したことがあります 削除/引用 No.1845-5 - 2005/12/26 (月) 13:14:02 - 学部四年 もう見ておられないかもしれませんが、 同様の現象を経験したことが自分にもあります。 そのプラスミドはサイズがでかくなったり、サイズが小さくなったりと、 約3/4の確立で異常なバンドになりました。 miniprep後に、正常なサイズをもう一度撒き直し、 再びminiprepを行いましたが、やはり異常なバンドが出ました。 おそらく非常に不安定なプラスミドであろうと言う事で、 正常なサイズのものだけ、回収して使用しました。 (特別な理由で、プラスミドの安定性が必要でなかったため)

(無題) 削除/引用 No.1845-4 - 2005/12/22 (木) 14:06:06 - vector ゲルで確認できるような量（数十ng以上）のインサートとベクターをライゲーションして、まともな効率のコンピテントセルを使って、コロニーが数十個というのはあまりに少ないです。ライゲーション自体が上手くいっていないと考えられます。 インサートのPCR産物の制限酵素部位が末端に近いため消化が不十分か、ベクター調製時に使ったCIAPの持ち込みなどの原因で、正常なライゲーション産物ができにくい条件だと、ノンスペシフィックな切断を受けたベクター由来の微量のDNAが自己環状化して、ベクターより小さなプラスミドとして回収されることがありますので、そのせいではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1845-3 - 2005/12/22 (木) 01:45:51 - あべる 私もそのようなことを経験したことがあります。 はっきりした原因はわかりませんが、おそらく”何か”がコンタミしたのでしょう。 改善策としては、できるだけDNAをきれいに精製することくらいでしょうか。（wash回数を増やすとか） また、プラスミドのサイズが大きくなるほどtransformation効率は悪くなるらしいので、これだけ改善しただけではうまくいくとは限りませんが、がんばってみてください。

ゲノムでは？ 削除/引用 No.1845-2 - 2005/12/20 (火) 19:09:36 - pen どのくらい大きいのかはわかりませんが、ゲノムではないでしょうか？ アルカリ処理などでゲノムが切断されてしまうと、 蛋白質と一緒に上手く沈殿せず、 プラスミドと一緒に取れてきてしまうことがあります。

スーパーコイルドより移動度の大きいバンド 削除/引用 No.1845-1 - 2005/12/19 (月) 13:45:36 - 実験初心者 蛋白発現実験でつまづいている実験初心者です。 8.5kbのinsert(PCR産物)を5.5kbのplasmidにLigationし、 DH5αにTransformationしました。 ネガコンが5colonyくらいで 目的のSampleは10〜20colonyでした。 そのColonyをminicluture後、miniprepして 制限酵素処理前に一度泳動してみました。 すると、Controlである空Vectorのスーパーコイルドのバンドよりも 移動度の大きいバンドがいくつもあり(しかもそれぞれ移動度が異なる) その後の制限酵素で切れないものばかりでした。 Controlと同じ位置にあったバンドは制限酵素できれて、insertのない 空Vectorでした。 このような経験された方、おられないでしょうか？ 教科書的にはスーパーコイルドのバンドよりも移動度の大きいバンドは 変性したplasmidと言われていますが、 Miniprepの際のアルカリ処理が原因なんでしょうか？？ ご教授お願いします。

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