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(無題) 削除/引用 No.1898-14 - 2007/08/04 (土) 12:34:58 - 匿名 細胞の固定法によって、GFPは細胞外へ流出するようです。

ありがとうございます 削除/引用 No.1898-13 - 2006/01/30 (月) 23:06:43 - 初心者実験者 みなさん、本当に貴重なご助言有難うございます。 皆さんのご助言を参考に、根本的に考え直してみます。

(無題) 削除/引用 No.1898-12 - 2006/01/27 (金) 09:29:23 - マウスのBMTしてます 「しまじろう」さん、おしゃるとおりです。素性のはっきりしたものを目的に応じて選択しMTA作ってルールに沿って用いれば問題ないわけです。 私はJaxのを使っていますのでJaxのgreen miceではと読んで頂けるかと思います。もしこれが「初心者実験者」さんご自身の実験目的にあうmaterialであるとお考えなら入手されたらよいかと思います。 Jax-green mice（つまりポジコン）では末梢血をACKlysingしなくても蛍光顕微鏡で容易にgenotypingならぬphenotypingできるくらい明るいです。ただフロー用ではFSCxSSCではっきりlymphocyte populationが見えるくらいは溶血操作は必要でしょう。CD45 gatingはしていません。 問題なのは「初心者実験者」さんのポジコンが光らないということですよね。フローなどでのテクニックのこと以外にポジコンが真にtransgeneを持っているかということは確認要ですよね。恐らくポジコンは実験用と同じラインのpupsを使っていらっしゃるでしょうし。

現状報告です 削除/引用 No.1898-11 - 2006/01/26 (木) 20:02:16 - 初心者実験者 「しまじろう」さん、「似たようなアッセイしてましたが」さん、貴重なご意見有難うございました。 いろいろ試しています。現状、自分のなかで「これが原因では？」と考えているのはRBCの除去がしっかりできていないことだと思います。 lysing bufferは、いろいろ読んでみると、BDのPharmLyseを使用されている先生や、自分で作られている先生がいるようです。BDのPharmLyseの説明書に4℃-8℃で、保存が6ヶ月と書いてありました。 この2つに質の違いはあるのでしょうか？ もしかしたら、私はvortexを不十分にしていたために、完全にRBCが除去できていなかったのかも・・・ 　と考えているうちに、雑用を頼まれ、まったく進行しておりません（涙）

(無題) 削除/引用 No.1898-10 - 2006/01/26 (木) 09:48:37 - 似たようなアッセイしてましたが RBC lysisは徹底的にやってしまってよいと思います。１５分RTとかを二回繰り返しても 結構な量が残りますが，EGFP発現の解析ていどはできます。 viabilityもその目的に使う程度なら、問題はないとおもいますが、どうしても心配なら 遠心の際にFCSの上に細胞をoverlayしたりすると、気休めになるかと思います。 当面の問題は何となくFACSの条件設定やgatingの問題ではないかと推測します。 使用しているマウスの血球が光っているかどうか心配なら，RBC lysisだけして、 普通の蛍光顕微鏡でwtマウスの血球と比較するのが手っ取り早いのでは。

ＧＦＰマウス 削除/引用 No.1898-9 - 2006/01/25 (水) 23:01:47 - しまじろう 岡部先生らのＧＦＰマウスと言っても、理研とＪＡＸのものとでは特性が全然違います。 http://133.1.15.131/tg/TGFISHresult1.cfm ここ最近は、マウスにも知的財産権などが絡んで来ることも多く、理研にしてもＪＡＸにしても、入手したマウスの譲渡は不可のはずです。 どんな研究成果を出しても、つまらないところでケチがついてしまっては元も子もありません。 素性の確かなマウスを使うべきでしょう。

マウスのBMTしてます　さまへ 削除/引用 No.1898-8 - 2006/01/20 (金) 16:40:36 - 初心者実験者 「マウスのBMTしてます」さま、貴重なメールありがとうございます。 先生のメールを拝見した後、当方のTgマウスのstrainを確認しました。先生のおっしゃる、岡部先生が作られた、EGFPマウスとやらのようです。したがって、マウス自体には問題がなさそうです。 そこで先生にぜひご意見を伺いたいのですが、私のやりかたでどこかおかしな点や、先生の方法と違っている点はございますでしょうか？ pipetingの仕方が荒いとか、素人が陥りやすい注意点などございましたら、是非お教えいただけませんでしょうか？宜しくお願い致します。失礼します。

(無題) 削除/引用 No.1898-7 - 2006/01/20 (金) 04:24:58 - マウスのBMTしてます 問題はご使用の「GFPマウス」とは何者かということですね。 Jaxが売っている岡部先生らのグリーンマウス、beta-actin promoterでEGFP光らすやつなら赤血球以外は血球細胞のみならずほとんど99%の有核細胞でGFP陽性です。移植後でもFL1で高輝度にdetectできます。

なるほど 削除/引用 No.1898-6 - 2006/01/17 (火) 21:50:44 - 初心者実験者 P2さん、有難うございます。非常に参考になります。 今使用しているGFPマウスは、現在当研究室にいない先生が、以前理研（？）からいただいたようです。 GFPマウスでも血球が光らないヤツがいるなんて・・・しらなかった。 仮に血球がGFP+だとしたら、やはり私の実験工程自体に問題があるのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1898-5 - 2006/01/17 (火) 03:36:42 - P2 そもそもGFPマウスの血球が本当にGFP陽性ですか？ ・血球細胞は細胞質が小さいので、元々あまり明るくないGFP Tgマウスでは検出できないかもしれない ・GFPのプロモーターが何かは知りませんが、血球細胞で何らかの理由により、たとえばメチル化で不活化されているかもしれない まずは現在使っているGFPマウスで血球細胞がGFP陽性であるという論文なりデータがあるかを探す必要があるかもしれませんし、別のGFP Tgマウスを手に入れるのが早道かもしれません。

ご報告します 削除/引用 No.1898-3 - 2006/01/16 (月) 23:41:07 - 初心者実験者 ご報告させていただきます。 抗体は一切使用していません。 PhermLyseを使用して赤血球を除去したあとは、FSCとSCCのdot plotからgateをかけて、そのあとはFITCを横軸としたヒストグラムで検出しているのみです。 理論的にはそれでできると考えていたのですが、やはり素人の私の考えはアマイでしょうか？CD45PEなどで、しっかり顆粒球のみにしてGFPを検出したほうが確実でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1898-2 - 2006/01/16 (月) 15:12:38 - ごんた 質問返しになりますけど確認時に使用する抗体は何を使っているのでしょうか？ CD45PE? 詳しくかつ正確に教えてください

GFPマウスの骨髄移植の確認 削除/引用 No.1898-1 - 2006/01/08 (日) 13:27:25 - 初心者実験者 ハイレベルな質問の中、低レベルなことをお聞きして申し訳ございません。 いま、WTマウスに放射線をかけて（9Gy)、GFPマウスの骨髄を移植しているのですが、その確認方法のフローサイトメトリーが上手くいきません（涙）。 ・マウスのしっぽを切って血液を採取し、EDTAと混和（室温、凝固なし） ・BD社のPharmLyseを使用して赤血球を除去 ・FACSCaliburでGFP陽性細胞があることを確認 という流れを期待しているのですが、ポジコンとして用意したGFPマウスの血液すら上手くGFP+と言えません。GFPマウス自体には問題は無いようです。 自分でいろいろ試行錯誤(EDTAの量だとか、PharmLyseの量だとか）はしてみたのですが、どうしても上手くいきません。 ひとつ気になるのは、PhaemLyseをしても、幾分赤血球が残っているのを認めるのですが、これは問題ないのでしょうか？きれいに除去しようとしたら、かなり時間がかかってしまい、死細胞が増えてしまうような気もするのですが。 くだらない質問で申し訳ございませんが、藁をも縋る気持ちで質問させていただきます。どなたか思い当たる原因や解決策を教えていただければ幸いです。失礼します。

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