全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

Overview 削除/引用 No.2231-24 - 2007/09/17 (月) 07:31:24 - Visitor526 I have visited your site 034-times

本当に有難う御座いました。 削除/引用 No.2231-21 - 2006/04/09 (日) 15:58:07 - 蛋白屋 今日UVを使わないでゲル抽出したしたベクター、インサートを 使ったライゲーションで無事コロニー（500以上）を得ることが できました。もちろんまだシークエンスの確認などを行って いませんがネガティブコントロール（ベクターのみの ラーゲーション）とのコロニー数を比較した感じで 実際にほしいクローン得られていることはほぼ間違いないと 思います。 アドバイス頂いた方々本当に有難う御座いました。

アドバイス頂いた方々本当にありがとう御座いました 削除/引用 No.2231-20 - 2006/04/09 (日) 15:51:17 - 蛋白屋

たくさんレスを頂き有難う御座いました。 削除/引用 No.2231-19 - 2006/04/08 (土) 02:32:17 - 蛋白屋 大変たくさんのレスを頂き有難う御座いました。 全てを引用して書き込むと長くなってしまうので自分の文章のみで 返信させて頂きます。 サチ様 情報有難う御座います。今回は別のレーンに少量のサンプル平行して 流してそのレーンだけにUVを当てて距離を確認した後、該当のバンドが あると思われる部分のゲルを切り出し精製することによって無事抽出する ことができました。 T様 UV機器についてですが実は今年新しい場所に引っ越したのに伴い 機器を全て入れ替えています。現在のUVはゲル写真の撮影に使って いるもので強さを100%と70%に切り替えられるものの波長については はっきりわかっていません（実はここはヨーロッパのある研究室です）。 以前は2種類のUV機器を使い分けていてその時には切り出しように長 波長のものを使っていました。ここ3ヶ月でクローニングをしているの は自分だけなので、切り出し時UVの影響は十分に考えられると思います。 J様 pQE9の制限酵素サイトはEcoRIとSalI、pPICZの制限酵素サイトはXhoIとXbaIです。インサートに関してはpQE9用には同じ制限酵素サイトを、pPIC用にはSalIとXbaIを使っています。SalIとXhoIのライゲーションが上手くいかないことがあるとどこかのトピで見かけたので多少気になっています。 T、J、UV様 DNA抽出に使っているキットですが既に名前のあがっているGenElute Gel Extraction Kit を使っています。ここ数年同じキットを使って問題なく ライゲーションができていたのでキットに関しては問題ないかと思います。 Fu様 情報有難う御座います。UVや毒性の対処をしても尚解決できない場合に 試しみたいと思います。 最後に本日UVを使用しないでpPICのベクターとインサートをゲルから 抽出し新しいライゲーションを行いました（ボスとの話し合いでここ 2週間はPhichaの系に集中することになりました）。日曜日には結果が 出るので遅くとも月曜日には報告させて頂きます。設定の解決の欄を チェックして報告できるといいのですが。では。

毒性 削除/引用 No.2231-18 - 2006/04/07 (金) 14:36:13 - Fu 以前、Sal1の末端感受性について指摘した者です。 蛋白屋さんのレスでEcoSal間が20bp有るという事なのでT-vectorからpQEへのリライゲーションでのSal1などの末端感受性は問題ないと思います。 （ちなみに、制限酵素の末端感受性についてはhttp://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp#Sが便利ですよ） 目的断片がコードする蛋白質の影響 　以前、RNA結合性蛋白質のコンストラクションをしていた際、手間取った事があります。結局はっきりと原因はわかりませんが、恐らく大腸菌内でRNAに結合してしまう事が何らかの悪影響を及ぼしていたのだと思います。その際、私が解決した方法は薬剤選択プレートを30度で培養する事でクリアー出来ました。イメージとしては「低温の為、RNA結合性蛋白質のコンフォメーションが変わった事で毒性が低下した」です。（ウソかも知れません。あくまで想像） 蛋白屋さんの場合に、合うかわかりませんが、何かのヒントになればと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2231-17 - 2006/04/07 (金) 11:26:28 - Ｔ ああそうかもしれませんね。 GenElute Gel Extraction Kit ならシリカカラムです。

(無題) 削除/引用 No.2231-16 - 2006/04/07 (金) 11:20:16 - UV GenElute™ Agarose Spin Columnsなら、シリカマトリクスではなくて単なるフィルターです。私はこれで得られたDNA溶液をフェノール抽出（フェノール・クロロホルムでは持ち込みのアガロースが除けない）後、エタノール沈殿して使っています。

(無題) 削除/引用 No.2231-15 - 2006/04/07 (金) 11:12:03 - Ｔ > Sal1は比較的末端に近い領域にある場合、認識・切断されにくいはずです。 > が妥当なところだと思います。 TA cloning したものを切り出していると書いてありますが．．． > S社の切り出しキットはゲル片を遠心するだけのものと違いますか？ GenElute だとしたら、シリカに結合させる式のものです。これも初めて使うなら分かりませんが、これまで使っていて問題がなかったのなら、今回の原因とはちょっと考えにくいのでは？ まあ案外単なる試薬のコンタミということもあり得ますから、一度使う試薬を全部取り替えるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2231-14 - 2006/04/07 (金) 10:49:33 - J pQEとpPICとで、使用している制限酵素が異なり、どちらもクローニングできないのであれば、SalIはあまり関係なくて、�@切り出しの問題と�A毒性の問題にしぼられると思います。 まず、�@ですが、蛋白屋さんが使ってるS社の切り出しキットはゲル片を遠心するだけのものと違いますか？あれで精製するとligationはおそらくうまくいきません。他社製品に変えてみてください。 �Aですが、ホストはQ社の発現用株を使用していてダメということならベクターを変えるしかないと思います。大腸菌ならpETcoco、酵母なら違うプロモーターのものに変えてみてはどうでしょうか？ pPICと同じくI社からでているS.pombeのベクターはチアミンでかなり厳密に発現制御できたと記憶しています。ピキアではないですが、、、

(無題) 削除/引用 No.2231-13 - 2006/04/07 (金) 09:52:52 - bananafish Eco Salさんの Sal1は比較的末端に近い領域にある場合、認識・切断されにくいはずです。 が妥当なところだと思います。僕も同じ経験がありますよ。あとPCRプロダクトが制限酵素サイトまで伸びきっていないためにcloningのときかみ合わないというケースもありました。このときの対処法としては １）PCRのextention timeを通常の二倍程度に設定し、final extensionを10　　分にする。 ２）PCR productをTA cloningしてから制限酵素で切り出す。 この方法で会費でいると思います。Sal�Tの切断が容易になるはずです。 急がばまわれといったところでしょうか。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.2231-12 - 2006/04/07 (金) 09:17:01 - Ｔ これが初めてのライゲーションなら別ですが、今まで同じ条件で別のサブクローニングは問題なかったならＵＶの影響とは考えにくいのでは。 やはり毒性の問題が第一に疑われます。プラスミドのコピー数が少なくなるものなど、毒性のあるもの向けの大腸菌を使ってみては？

フナコシの製品で 削除/引用 No.2231-11 - 2006/04/07 (金) 08:27:07 - さち UVを使わずに（エチブロなしで）ゲルを染色してバンドを目認・切り出しできる製品があります。 バンド自体が薄いので、同条件で泳動、UVで確認後写真を参考に切り出しを 行っています。 フナコシの「Gel　Indicator　Kit」という製品です。

(無題) 削除/引用 No.2231-10 - 2006/04/06 (木) 18:04:24 - 蛋白屋 >[Re:9] ○さんは書きました : > ゲル抽出にはキットを使用していますか？ > スピンカラムからの溶出の前に、よーくカラムを洗わないと、塩やその他buffer成分が混入することがあり、ライゲースの活性が低下する事があるようです。対処法としては、 > １．カラムをよく洗う > ２．なるべく高濃度のDNA溶液を調整し、Ligation反応液には少量、添加する（反応液で混入物を希釈する意味で・・・。） > 後輩が同じように悩んでいましたが、ゲル抽出産物をethanol沈殿し、70%エタノールでしつこく洗浄したあと高濃度のDNAを使用して反応させたところ、上手くいったようです。 > こんな事しなくても、普通にやったら上手く行くはずですが・・・。 > 上手く行かない時は、可能性のあることを一つずつ潰していくしかないですからね。がんばってください。 ○様 アドバイス有難う御座います。 ゲル抽出はシグマのキットを使っています。次回抽出する時には気をつけて 洗ってみます。

(無題) 削除/引用 No.2231-9 - 2006/04/06 (木) 12:42:34 - ○ ゲル抽出にはキットを使用していますか？ スピンカラムからの溶出の前に、よーくカラムを洗わないと、塩やその他buffer成分が混入することがあり、ライゲースの活性が低下する事があるようです。対処法としては、 １．カラムをよく洗う ２．なるべく高濃度のDNA溶液を調整し、Ligation反応液には少量、添加する（反応液で混入物を希釈する意味で・・・。） 後輩が同じように悩んでいましたが、ゲル抽出産物をethanol沈殿し、70%エタノールでしつこく洗浄したあと高濃度のDNAを使用して反応させたところ、上手くいったようです。 こんな事しなくても、普通にやったら上手く行くはずですが・・・。 上手く行かない時は、可能性のあることを一つずつ潰していくしかないですからね。がんばってください。

皆さんたくさんの返信を頂き有難う御座いました。 削除/引用 No.2231-8 - 2006/04/05 (水) 16:56:10 - 蛋白屋 皆さんたくさんの返信を頂き有難う御座いました。 正直なところアドバイスを１つでも頂ければと思って トピを立てたもので本当に感激です。 Fu様 EcoRIとSalIの距離に関してはpQE9では20bp以上の距離があるので 問題ないかと考えています。 酒多飲様 もしこの場合だとしたらプライマーの設計からやり直しということに なりそうですね。これに関しては他の可能性（UVや毒性の問題など）を 確認してみてまだ同じ状況であった時に再度検討させて頂きます。 gene様 そのようなことあるんですね。少なくとも酵母の発現ベクターに 関してはほぼ無いだろうと予想していたんですが。大腸菌の発現ベクターに 関してはグルコースを入れるなり対処法がありますが（Lacプロモーター なので）もし大腸菌中で酵母のベクターから発現が漏れているとしたら 抑えるのは難しそうですね。 UV様 皆さんのアドバイスを参考にUVをなるべく使わないでベクターと インサートを調整しなおすことから始めるつもりです。まとめて 詠ませていただきます。まとめて頂き感謝します。

(無題) 削除/引用 No.2231-7 - 2006/04/05 (水) 11:55:09 - UV DNAのUV曝露の影響に関しては、次のようなトピがあります。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=13;Code=1135 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=1660 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=1778 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=4;Code=999

(無題) 削除/引用 No.2231-6 - 2006/04/05 (水) 11:43:41 - gene プロテアーゼなんて細胞の中で悪さしそうですし、やはりleakyに発現しているのではないでしょうか。 異種のプロモータが大腸菌のなかではたらいてしまうことも少なからずあるようです。 transgenic用に、真核生物遺伝子のプロモータを含み、lacZやGFPなどのリポーターを融合させたコンストラクトをつくって大腸菌でクローニングしたら、lacZが発現してX-gal添加で青くなったことや、GFPが発現してブラックライトで光ったという経験があります。 毒性をもつ遺伝子のクローニングについての過去トピを参考して試してみてはいかが

１度だけの経験ですが、 削除/引用 No.2231-5 - 2006/04/05 (水) 09:54:19 - 酒多飲 　ある遺伝子をクローニングして、シークエンスを確認したものを切り出して、別のベクターに繋いだところ、コロニーが異常に少なく、変異のあるものしか取れなかったことがあります。遺伝子の塩基配列そのものに毒性があるならクローニングできないよなあと思っていたのですが、制限酵素を換えて切り出し繋ぎなおしたところ、正しいものが取れました。恐らく、つなぎ目を含んだ配列に問題があったのだと思います。 　きわめて稀な例だとは思うのですが、可能性としてゼロではない（限りなくゼロに近いとしても）ということでコメントさせていただきました。

Eco Sal 削除/引用 No.2231-4 - 2006/04/05 (水) 09:14:26 - Fu ベクター側のEco＆Salの距離は十分ありますか？ Sal1は比較的末端に近い領域にある場合、認識・切断されにくいはずです。 昔、私もBam＆Salで切断しようとして、Salがほとんど切れずに目的コンストラクトが得られないという経験があります。 参考になれば幸いです。 頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.2231-3 - 2006/04/04 (火) 22:21:02 - 蛋白屋 >[Re:2] UVさんは書きました : > 他のトピでも指摘がありましたが、ゲルからの切り出しの際にUVに曝露され過ぎると、形質転換効率が下がります。プラスミド中にチミンダイマーが一つあるだけで、形質転換能が失われるという話を聞いたことがあります。 レス有難う御座います。残念ながらチミンダイマーについての指摘 のあるトピは自分では見つけられませんでした。次回切り出す時は その点を気をつけてみます。

全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---