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(無題) 削除/引用 No.3152-18 - 2007/09/28 (金) 14:14:19 - まめせん 去年の１１月から情報提供がないため、更新がなかったと思います。 calbiochem社のキットで細胞質、細胞膜、核、細胞骨格を分画することはできます。どういう情報が必要なのでしょうか。

ｱｸﾁﾝのお話はもうやめたのですか？ 削除/引用 No.3152-17 - 2007/09/19 (水) 19:33:55 - もっくん 　ｱｸﾁﾝのお話、楽しく拝見させて頂きました。 一部繰り返しになりますが、形質膜、細胞質、ﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱ、核、細胞骨格を分けてそれぞれの画分のWBをするには、calbiochemのkitでできるんですよね？ また、お話を復活させませんか？

(無題) 削除/引用 No.3152-16 - 2006/11/11 (土) 10:12:27 - まめせん 話は横道にそれましたが、アクチンは核にも存在するようです。細胞骨格のマーカーはvimentinが良いようです。本筋の話になりますが、実際に何度か実験をして、co-IPすることは可能でした。ただ、100 mmディッシュで細胞を培養し、それをサンプルとして使う必要があります。もし、アクチンに結合するタンパク質の実験をしたいという人があれば、力になれるのではないかと思います。さらに自分は実際に実験経験をやっていて、エキスパートだという方の意見をもらえたら良いと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3152-15 - 2006/11/02 (木) 11:45:31 - Ｔ http://scholar.google.com/scholar?q=nuclear+actin&hl=ja&lr=&btnG=Google+検索&lr=

(無題) 削除/引用 No.3152-14 - 2006/11/02 (木) 10:51:56 - まめせん Tさんへ 核内にも、サイトスケルトン様の構造があるということでしょうか。 どの論文か分かりますか。 どうぞ宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3152-13 - 2006/11/01 (水) 16:40:26 - Ｔ 量は知りませんが、細胞骨格、細胞質に加えて核にもアクチンが存在するのは事実なのでは。クロマチンのリモデリングにアクチンが関わっているとかいう研究もありますね。分画法の問題ではないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.3152-12 - 2006/11/01 (水) 11:51:36 - まめせん 前回の発言に訂正があります。 F-ActinとG-Actinに結合するタンパク質があるようですので、脱重合させた状態と重合させた状態でco-IPする必要があります。前者の場合は、サイトカラシン類あるいはラトランキュリンなどが用いられるようです。また、後者の場合はファロイジンが用いられるそうです。 Calbiochemのキットでは、以前にも発言した通り、細胞質、膜/オルガネラ、核、細胞骨格と分離できるのですが、アクチンは細胞質、核、細胞骨格で検出されます。はじめは分離がうまく行っていないと思っていたのですが、メルクの担当者から細胞質、核、細胞骨格でアクチンが聞きました。これは一般的なことでしょうか。分離方法によってコンタミは多少なりともあると思いますが。私の実験では異なる分離方法で実験を行う必要があるようです。

actin-binding assay 削除/引用 No.3152-11 - 2006/10/23 (月) 16:58:07 - まめせん 科研の申請で忙しくしており、実験はあまり進んでいませんし、こちらに来ることもできず、返答が遅れて申し訳なく思っています。 actin-binding assayなるものを発見しました。参考になさって下さい。 Scar1 and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex Laura M. Marchesky and Robert H. Isall. Current Biology 1998, 8:1347-1356. ポリマーになっているかどうかはあまり重要ではないと考えています。単量体であろうが、直接あるいは間接的に相互作用していることを証明できればいいと思っています。サイトカラシン類はアクチン重合阻害剤なので、これを用いることで、co-IPできる可能性は高いように思います。 それでは。

(無題) 削除/引用 No.3152-10 - 2006/10/08 (日) 04:21:11 - TS 私も以前に試みようと思ったのですが、どうにもうまくいく気がしなくてやめました。というのは、polymerized actinを可溶化するのに、SDSが必要になってくること、Co-IPを見るのにdetergentしか使えないこと（変性させないために）、が挙げられます。つまりpolymerized actinを溶かそうとすれば、タンパク質相互作用が維持されないし、維持しようとすれば、actinが溶けない。「あちら立てば、こちら立たず」という感じです。。。私の力量では解決できませんでした。 ただこのトピの中にもありましたが、actinの脱重合試薬を使うことができるかもしれませんね。タンパク質の相互作用を維持したまま、depolymerizeさせられれば解決です！脱重合試薬が試験管レベルで作用するのかは謎ですが。できたらご報告お願いします！ >全細胞でのアクチンとのco-IPができれば、細胞骨格にあるタンパク質があ >るということが間接的に分かるということですね。 これについてですが、polymerized actinでなくてもよいなら、ありですね。 ただこの場合、キットで分画された細胞骨格画分にある「目的タンパク質」とCo-IPで検出される「目的タンパク質」は、だぶりませんが。なぜなら、前者で検出されるタンパク質は、polymerized actinと相互作用していて、後者で検出されるタンパク質は、depolymerized actinと相互作用してることになるからです。 解決策は見いだせませんが、私の意見と言うことで、コメントがありましたらお願いします。興味深い系ですので。

補足です。 削除/引用 No.3152-9 - 2006/10/07 (土) 12:38:53 - まめせん Extraction Buffer IVにはSDSが含まれているようです。これではIPすることはできませんね。 各フラクションでのタンパク質局在と、全細胞でやるco-IPで結果を見るしかないですね。つまり、あるタンパクがアクチンと同じフラクションにあり、全細胞でのアクチンとのco-IPができれば、細胞骨格にあるタンパク質があるということが間接的に分かるということですね。

(無題) 削除/引用 No.3152-8 - 2006/10/07 (土) 07:55:00 - まめせん お返事ありがとうございます。 うまく行かなければ、ホルマリンで固定してから分画するか、分画せずにco-IPしようと考えていました。先生のおっしゃる通りだと思います。アクチンの阻害剤としてはサイトカラシン類を考えていますが、Dを使用している例が多いのでサイトカラシンDを使用するつもりでいます。 > 細胞の破砕、バッファー添加による相互作用の変化は十分考えられます。 > しかし、現実として細胞の破砕、バッファー添加なしにはIPできませんので、ほとんどすべての> 報告されたIPによる結合は、細胞の破砕、バッファー添加（さらには分画）で壊れなかった結合> ということです。 > よく、他のグループによる結合の再現性が得られないという話がありますね。 > よって、すべては結果がよければモノがいえる程度のことで、技術的な限界をよく認識する必要> があります。 > 例外的に、クロスリンカーで結合を（たとえば、細胞ないで、もしくは分画のときに）安定化さ> せることが考えられます。が、これもクロスリンカーなしで結合がみられないと論文として通ら> ないことが多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3152-7 - 2006/10/07 (土) 07:28:23 - 技術的な限界 細胞の破砕、バッファー添加による相互作用の変化は十分考えられます。 しかし、現実として細胞の破砕、バッファー添加なしにはIPできませんので、ほとんどすべての報告されたIPによる結合は、細胞の破砕、バッファー添加（さらには分画）で壊れなかった結合ということです。 よく、他のグループによる結合の再現性が得られないという話がありますね。 よって、すべては結果がよければモノがいえる程度のことで、技術的な限界をよく認識する必要があります。 例外的に、クロスリンカーで結合を（たとえば、細胞ないで、もしくは分画のときに）安定化させることが考えられます。が、これもクロスリンカーなしで結合がみられないと論文として通らないことが多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3152-6 - 2006/10/07 (土) 07:16:26 - まめせん TS様： 各ステップでペレットができますが、すべて溶液に溶かします。細胞骨格も溶液に溶かしますが、変性しているかどうかは組成が示されていないので分かりません。現在、メルクに問い合わせ中です。もし、アクチンが変性していなければ、フラクショネーションしても、co-IPは可能と言う意見でしょうか。 > 便乗で大変恐縮ですが、大変興味がありますので、質問させてください。 > Calbiochemのキットでは、細胞骨格画分はペレットとして分画されるのではないかと推察しま> す。 > Co-IPのサンプル調製のために、polymerized actinをどのような方法で可溶化するのでしょう > か？ > detergentには不溶ですし、変性させたらCo-IPできないですよね？ > 当該トピックの主旨がここにあるのではないかと思うのですが、ご経験があるようですので、よ> ろしければご説明いただけると、大変参考になります。 > よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3152-5 - 2006/10/07 (土) 07:06:38 - まめせん お返事ありがとうございます。 私がお聞きしたいのは細胞分画によって、生体内の相互作用が乱れてしまうのではないかということです。例えば、細胞分画によってアクチンと相互作用していたものがIPで見られなくなるのではないかという懸念です。分画しても相互作用は維持されるという考えでいいのでしょうか。 1. Co-IPです。あるタンパクでIPしてアクチンをWBで検出あるいはその逆で確認したいと考えています。 2. 今は予備実験の段階ですが、F1、2、4で検出されます。 > 使う細胞／targetは違うでしょうが、その他はほぼ全く同じ事をした経験があります。 > 1)いわゆるCo-Immunoprecipitationですよね？ > 2)目的とする細胞のproteioexact-F4にactinが含まれる事はWBで確認されましたか？ > それが見られないようでは......ですよね。

F-actinの可溶化方法 削除/引用 No.3152-4 - 2006/10/07 (土) 06:20:01 - TS 便乗で大変恐縮ですが、大変興味がありますので、質問させてください。 ...様： Calbiochemのキットでは、細胞骨格画分はペレットとして分画されるのではないかと推察します。 Co-IPのサンプル調製のために、polymerized actinをどのような方法で可溶化するのでしょうか？ detergentには不溶ですし、変性させたらCo-IPできないですよね？ 当該トピックの主旨がここにあるのではないかと思うのですが、ご経験があるようですので、よろしければご説明いただけると、大変参考になります。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3152-3 - 2006/10/07 (土) 04:15:23 - ... 使う細胞／targetは違うでしょうが、その他はほぼ全く同じ事をした経験があります。 1)いわゆるCo-Immunoprecipitationですよね？ 2)目的とする細胞のproteioexact-F4にactinが含まれる事はWBで確認されましたか？ それが見られないようでは......ですよね。

免疫沈降 削除/引用 No.3152-2 - 2006/10/05 (木) 08:43:44 - まめせん こういった実験を行ったことがある方、もしくはやろうしてしている方、連絡をいただけると幸いです。

アクチンでIP 削除/引用 No.3152-1 - 2006/09/28 (木) 10:02:21 - まめせん アクチンと直接的あるいは間接的に相互作用していると考えられる分子をIPすることによって、証明したいと考えています。もし、アクチンとの結合をIPで解析されたことのある方がいらっしゃいましたら、いろいろとご教授願いたいと思います。1) 技術的に可能であるかどうか、2) Calbiochem社のProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kitを用いて細胞質、膜、核、細胞骨格に分けたときに、細胞骨格分画から目的のタンパク質をアクチンと共沈してくることが可能かどうか、(試薬で溶解すると、相互作用が見られなくなるかどうか) 細胞はHUVECを使います。

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