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ザイモの注意点など 削除/引用 No.3570-4 - 2007/06/25 (月) 10:25:09 - まさ ザイモグラフィーで苦労しています。 いままで５回やって１回はちゃんと市販のコントロールのバンドが出ましたが、１回はぼやっと、後は失敗です。 これまでに気づいた、注意すべき点として、 細胞などのサンプルを、インヒビター入りのサンプルバッファーで処理しない 蛋白をボイルしたり2-MEなどを反応させない(当然？) SDSは高純度のものを用いる(ウエスタン用のものよりバンドが出やすいらしい) 泳動は４℃以下でおこなう といった所でしょうか。他にも注意点などありましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3570-3 - 2006/12/26 (火) 10:30:19 - ザイモにはまり・・・ お菓子を作るときと同じ・・・確かにそうですよね！実は室温でゲルの溶液に直接いれて何時間も振トウさせて作っていました。早速高めの温度で溶かしたゼラチン溶液を使ってみます。どうもありがとうございます。

ゼラチン 削除/引用 No.3570-2 - 2006/12/23 (土) 18:31:27 - mom 今はどのようにしてゼラチンを溶かしているのですか？ ゲルの溶液に粉末を溶かそうとしているのなら、難しいと思います。 予め水溶液にしたものを混合するようにしないと駄目です。 お菓子（ゼリーなど）を作るのにゼラチンを使う時は、少量の水でふやかしてから加温しますが、あの要領です。ダマにならないように少しづつ水に振り入れるようにし、加温（沸騰させない）してやると早く溶けます。 ずいぶん昔にやったので、濃度などを覚えていないのですが、おそらく5〜10倍濃度で溶かしたものを（温度が下がってゲル化していたらあたためて溶かしてから）ゲル溶液に加えれば、ゲル内の濃度を落とす必要はないと思います。 白抜きのバンドがきれいに出ない件については、ゲルの問題なのか、そもそも培養液中のMMP濃度が少ないせいなのか、これだけではよくわかりません。positive controlは入れていますか？ ちなみに、泳動後の処理ですが、（こちらもバッファーの組成までは覚えていませんが）私は37度で一晩行っていました。

ゼラチン ザイモグラフィー 削除/引用 No.3570-1 - 2006/12/23 (土) 16:57:40 - ザイモにはまり・・・ 肝細胞癌でMMP2/9のザイモグラフィーを試みているものです。 サンプルは培養上製（serum抜きの状態で24時間10cm dishで5mlのmediumでカルチャーした後にsupを回収し還元剤抜きの６×サンプルバッファと混合・アプライ量は濃縮なしでvolumeが20μl）です。 ゲルは８％SDSポリアクリルアミドゲルにゲラチン（Sigma社のtype�TGelatin）を1mg/ml混合しています。サンプルをSDS-PAGEで展開した後にゲルをzymogram renaturation buffer [2.5 % Triton X-100]で１H洗浄しSDSを抜いた後にzymogram development buffer [50 mM Tris, 40 mM HCl, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2, and 0.2 % Briji 35]で12時間室温で振トウしています。その後クーマシーで染色した後に脱色しています。 まず、ゲルを作る際にゼラチンがなかなか溶けにくくて困っています。さらにMMP2/9の白抜きのバンドがきれいに出ずに悩んでいます。ゼラチンが溶けにくいのでゲル内での濃度を1mg/mlから1%に落とした条件で試みてもだめでした。そこで今度はサンプルを培養細胞自体（シリンジで細胞を破砕し還元剤抜きの2×サンプルバッファーと混合・アプライ量は10μg）でやってみようと考えています。 特にゼラチンを上手く溶かす方法などご教示いただけますと幸いです。

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