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(無題) 削除/引用 No.3775-16 - 2007/02/19 (月) 17:14:38 - はろ detoxさま > pcDNA3と同じCMVプロモーターとマルチクローニングサイトを持ちながら、コピー数が低いベクターに、pcDNA-Ampというのがあります。これを使うとクローニングできるかも知れません。 > あるいは、pcDNA3のコピー数を低く保って、毒性クローンの保持を容易にする次のようなホスト株が有効かもしれません。 貴重な参考資料ありがとうございます。 今回のプラスミドですが、以下に記す方法で培養を行い、わずかではありますが取得に至りました(つい先ほど、結果が得られました)。 但し、次の段階の操作として、これをフラスコでの大量培養系へ移してプラスミドの大量取得を行う必要があり、その系でまた増えなくなった場合、上記のベクターやホストについて検討させていただきたく思います。(今回うまくいった下記小スケールを何十本とする・・・という方法もあるのですが、本数が大量になりすぎるので現実的ではないのです)。 【うまくいった条件】 当初の操作で記載した画線培養プレートより、コロニーの形状も考慮してピックアップする ↓ LB(amp) 3 ml culture(100 ug/ml amp)で37℃，2時間培養 ↓ amp 100 mg/mlを3 ul添加する(final 100 ug/ml) ↓ 更に2時間培養 ↓ 上記と同じくamp添加 ↓ 2時間培養ごとにamp添加を繰り返す ↓ 9時間後に集菌、3 ml全量を使って即日プラスミド抽出 条件検討数が少ないので、温度を30℃にした状態で計時ごとにamp添加を行えばもっと収率がよくなるかもしれませんし、amp濃度についても見当すべきかもしれません。 とりあえず、平均と比べればわずかながらも、プラスミドが得られましたので、解決、とさせていただきます。 毒性のある菌体の形状や、そういった場合における培養の方法など、いろいろ勉強になりました。 ご回答いただいた皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3775-15 - 2007/02/17 (土) 00:30:41 - detox はっきりとは書かれていませんでしたが、30℃の培養でもダメだったということのようですね。プレートの大腸菌の生えが悪かったということからして、プラスミドが毒性を示しているということは間違いなさそうです。 pcDNA3と同じCMVプロモーターとマルチクローニングサイトを持ちながら、コピー数が低いベクターに、pcDNA-Ampというのがあります。これを使うとクローニングできるかも知れません。 あるいは、pcDNA3のコピー数を低く保って、毒性クローンの保持を容易にする次のようなホスト株が有効かもしれません。 http://www.stratagene.com/products/displayProduct.aspx?pid=297

(無題) 削除/引用 No.3775-14 - 2007/02/16 (金) 13:14:59 - はろ おお様 貴重なご返答ありがとうございました。 > 低い濃度(20ug/ml-)で増やしておいて(そうすると増殖のスピードが早くなりますので)ちょうどよい頃合に100ug/mlに持ち上げコピー数を増やすということもやります。そうすることで長い培養の期間に変なことが起こるのをさけれるように感じます。 なるほど。 現在の条件検討が本物大腸菌の増殖不良により失敗した場合は、この方法を検討させていただこうと思います。 > 残念ながら文献は知りませんが(もともと哺乳類の細胞、タンパクをやっていますので)プラスミドが大腸菌に悪さをする時よく出てくる話だと思います。科学的でなくてすいません。 いえ、ありがとうございます。 調査不足でした。調べてみますね。 とりあえず、今回の培養結果については結果に関わらず報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.3775-13 - 2007/02/16 (金) 11:02:47 - おお > 今日の実験予定として、プラスミド抽出まで持っていく培養時間を短くしてみようと思っていました。大体8時間も培養すれば従来なら充分な回収量が得られる経験があります。そして、さらにその培養中に、一回ampを追加投入(amp耐性菌のみを優先的に増やせる状況にしたくて)しようと考えていたのですが、、、 > (過去所属の研究室でampの効き目は初期にしかないから、追加投入するべきなんだ、と教授がおっしゃっていたのを思い出しまして・・・) > 私もアンプはへたるので臨機応変にやっています。あまり大腸菌が苦にしてないようだったら100ug/mlでやるかもしれません。低い濃度(20ug/ml-)で増やしておいて(そうすると増殖のスピードが早くなりますので)ちょうどよい頃合に100ug/mlに持ち上げコピー数を増やすということもやります。そうすることで長い培養の期間に変なことが起こるのをさけれるように感じます。 > amp濃度とプラスミドのコピー数に相関関係があるとは知りませんでした。 > 何か参考になる文献などありましたら、お手数ですが教えていただけませんか？ 残念ながら文献は知りませんが(もともと哺乳類の細胞、タンパクをやっていますので)プラスミドが大腸菌に悪さをする時よく出てくる話だと思います。科学的でなくてすいません。

(無題) 削除/引用 No.3775-12 - 2007/02/16 (金) 09:27:16 - はろ 皆様 ありがとうございます。 画線培養より取得したコロニーを培養し、抽出しましたがやはりプラスミドはいませんでした。 画線培養コロニーをプレートにつつきなおした私の言うところのBANKプレートの各コロニーの様子は小さく半透明で平べったく、37℃で一晩培養したとは思えない大きさでした。 もし、毒性うんぬんによりプラスミドの入った菌が増えにくいのであれば、もう一晩培養しても、コロニーの大きさに差はでないかも？と考え、おまけ実験てきにそのBANKプレートをもう一晩培養してみましたが、大きさに変化は殆どなく。37℃で二晩培養したコロニーとは思えない小ささでした。 ただし、画線培養で増えてきて、更にPCRでポジだったことを考えると、プラスミドが完全消失したわけではなさそうなのでなんとか取得できれば。。。と努力する次第です。 おお様 > 前者についてはここで少し前にカナマイシンとアンピシリンのプラスミドを同時に導入した場合何が起こるかについてかなりつっ込んだ議論をしています。 私もそのトピは拝見した記憶があります。 探してみますね。 > おそらくやりなおせばクローンを拾うことができると思います。念のため違う大腸菌株があれば代えてみてもいいかもしれません。 JM109があったように思うので、探してみます！ > 少し気になるのがアンプの量です。50 ug/mlぐらいでいいんじゃないでしょうか。プラスミドが大腸菌に悪さをしている可能性を考えるなら、大腸菌内のプラスミドのコピー数を下げるために20ug/mlぐらいに落としてもいいかもしれません。 今日の実験予定として、プラスミド抽出まで持っていく培養時間を短くしてみようと思っていました。大体8時間も培養すれば従来なら充分な回収量が得られる経験があります。そして、さらにその培養中に、一回ampを追加投入(amp耐性菌のみを優先的に増やせる状況にしたくて)しようと考えていたのですが、、、 (過去所属の研究室でampの効き目は初期にしかないから、追加投入するべきなんだ、と教授がおっしゃっていたのを思い出しまして・・・) amp濃度とプラスミドのコピー数に相関関係があるとは知りませんでした。 何か参考になる文献などありましたら、お手数ですが教えていただけませんか？ mom様 > > ノーカットのプラスミドAは見えてますか？ > とは、文字通り「ノーカット」、 > つまり制限酵素を加えないで抽出したプラスミドをそのまま泳動した時には > プラスミドは見えていますか？という質問ではないでしょうか？ ありがとうございます。 ノーカット＝酵素消化に供したときに切れなかったもの と、解釈してしまいました。 制限酵素に問題があって切れなかった場合、intactのプラスミドがそのまま泳動されるので、同意になるかと思っていたのですが、良く考えると全く違うことなので、ご指摘感謝いたします。 本題ですが、制限酵素消化サンプルを流す際、一緒に無処理のプラスミドも流しています。結果として、無処理サンプルにはプラスミドの影も形もありません。 ですので、プラスミド抽出のキットに問題があるのか、もしくは抽出に使用した菌液には回収できるほどのプラスミドが既に存在していなかったということかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3775-11 - 2007/02/15 (木) 02:06:03 - おお 原因は主に二つだと思います。PCRでインサートを確認していますので、そのコロニーがあたりのコロニーでない可能性。もう一つは頻度はともかく起こりうるプラスミドの脱落です。前者についてはここで少し前にカナマイシンとアンピシリンのプラスミドを同時に導入した場合何が起こるかについてかなりつっ込んだ議論をしています。ちょっと探しきれませんでしたが参考になることが書いてあると思います。カナマイシンとアンピシリンのプラスミドを同時に導入しアンプのプレートでセレクションし、そのクローンをカナマイシンプレートにまきなおすとその中にカナマイシン耐性のコロニーがあるという事を議論していました。 後者についてはdetoxサンが述べていますようにプラスミドが大腸菌にとって好ましくない配列を含む時よくおこります。このような場合はプラスミドが抽出されなかったり、どんな制限酵素で切っても同じところにバンドが現れたりと訳の分からないことが起こります。インサートが大腸菌から排除されてしまったり、耐性遺伝子だけ大腸菌のゲノムに取り込まれてしまったりしているんだろうと想像しますが、それについて詳細に調べたわけではありませんので実際についてはよく分かりません。頻度が低くても通常のプラスミドでも起こる可能せいが全くないと言えない事も考慮に入れたほうがいいかもしれませんね。 おそらくやりなおせばクローンを拾うことができると思います。念のため違う大腸菌株があれば代えてみてもいいかもしれません。 少し気になるのがアンプの量です。50 ug/mlぐらいでいいんじゃないでしょうか。プラスミドが大腸菌に悪さをしている可能性を考えるなら、大腸菌内のプラスミドのコピー数を下げるために20ug/mlぐらいに落としてもいいかもしれません。

横から失礼します 削除/引用 No.3775-10 - 2007/02/14 (水) 18:44:40 - mom > ノーカットのプラスミドAは見えてますか？ とは、文字通り「ノーカット」、 つまり制限酵素を加えないで抽出したプラスミドをそのまま泳動した時には プラスミドは見えていますか？という質問ではないでしょうか？ その時点では見えているのであれば、プラスミドはあったのに制限酵素処理中になくなってしまったわけで、ヌクレアーゼのコンタミの可能性もあるのでは？とおっしゃりたいのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3775-9 - 2007/02/14 (水) 18:13:22 - はろ 返答ありがとうございました！ A様 > ノーカットのプラスミドAは見えてますか？ 制限酵素処理の『切れ残り』のことですよね？ プラスミドAの切れ残りは見えていません。 制限酵素処理をしたものを泳動すると、そこに何もサンプルをアプライしなかったような、泳動写真が得られるのです・・ detox様 >プレート上のコロニーのサイズはプラスミドＡ＜プラスミドＢではありませんか。サイズのみならず、コロニーが平べったくて透明だったりしないでしょうか。 そうです。。少し気になっていたことではありました。 トランスフェクション直後のプレートでは、見た目コロニーの大きさや雰囲気に差はないのですが、colony direct PCRで作製するBANKプレートでは、プラスミドB導入菌と、プラスミドA導入菌はコロニーの大きさに差がありました。 コロニーの様相も、ふっくらしたコロニーではなく、平べったくて透明に近いものでした。 >BANKプレートと仰るのは、短期ストック用のマスタープレートのことですよね。 後述になりましたが、そのとおりです。個人的な呼び名で混乱させてしまってすみません。 >一晩画線培養したその表面は、一様に増えているのではなくて、透明な菌体と生えの良い菌体の斑になっていませんか。また、楊枝で突くと糸を引きませんか。 糸引きについては確かめてみます。 画線培養菌をcolony PCRする際、確かに生育の良い(ある程度の大きさの)コロニーと、そうでないコロニーがありました。そして、大きさのあるコロニーのみを拾い、PCRしてポジティブでした。 ただし、今日そのポジティブクローンをBANKプレートより液体培養に移しましたが、BANKのコロニーは画線培養のコロニーと雰囲気が一転し、小さく平らで透明になっていました・・・ > 毒性が問題になる場合には培養温度を30℃にしてコピー数を下げることが有効である場合もあります。 先ほど37℃で液体培養を仕掛けましたが、30℃に移してみます。 ピックアップしたプレートの段階で様相がおかしいので、液体培養で温度を変えても駄目かも知れませんが・・・・ A様、detox様、的確なアドバイスありがとうございました。

プラスミドBの制限酵素は？ 削除/引用 No.3775-5 - 2007/02/14 (水) 12:45:27 - A ノーカットのプラスミドAは見えてますか？ 見えているなら、EcoRI,NotIへのヌクレアーゼのコンタミの可能性は？ プラスミドBも同じ制限酵素で処理しているなら違いますけれど。

(無題) 削除/引用 No.3775-3 - 2007/02/14 (水) 11:59:56 - detox 書き忘れていたことがありました。BANKプレートと仰るのは、短期ストック用のマスタープレートのことですよね。一晩画線培養したその表面は、一様に増えているのではなくて、透明な菌体と生えの良い菌体の斑になっていませんか。また、楊枝で突くと糸を引きませんか。 そのような場合には毒性の可能性が高いと思われます。

(無題) 削除/引用 No.3775-2 - 2007/02/14 (水) 11:50:18 - detox プラスミドＡが大腸菌の生育に対して毒性がある場合に同じようなことが起こります。プレート上のコロニーのサイズはプラスミドＡ＜プラスミドＢではありませんか。サイズのみならず、コロニーが平べったくて透明だったりしないでしょうか。 アンピシリンの選択は培養のごく初期にしかかかっていません。ちょっと濁ったくらいで培地中のアンピシリンはほとんど分解されて失われています。プラスミドに毒性がある場合には、それ以降はプラスミドを失った大腸菌が優先的に生えていきます。 pcDNA3は大腸菌内で高コピーで増えるので、毒性が問題になる場合には培養温度を30℃にしてコピー数を下げることが有効である場合もあります。ただし、コピー数が下がるわけですから、収量はそれほど多くはありません。

プラスミドが消える理由 削除/引用 No.3775-1 - 2007/02/14 (水) 11:15:01 - はろ いつも参考にさせていただいております。本日は、原因が良く分からない事由によりクローニングが滞ってしまったため、原因や解決法など教えていただけないかと思い、記載させていただきました。現状を以下に記します。 【遺伝子Aのクローニング】 ・とある遺伝子Aをクローニングしていた ・両末端に制限酵素サイトをつけたプライマーで増幅 ・目的位置に増幅を確認 ・増幅断片を所定の制限酵素で処理 ・同制限酵素で処理したpcDNA3(AP処理済み)とライゲーション ・DH5αにトランスフォーメーション ・生育コロニーを８つ、爪楊枝でピックアップし、BANKプレートに植菌 (BANKプレートは37℃で一晩培養後、４℃で保存) ・植菌後の同爪楊枝をcolony direct PCR用反応液を分注したPCRチューブに挿す ・T7，Sp6を用いてcolony direct PCRを行う ・colony direct PCR samplesを直接シーケンス ・クローニングPCR増幅操作による塩基置換が起きていないのは、８個中１個だった 【プラスミドA(遺伝子A)のプラスミド抽出】 ・このポジティブ１個を、BANKプレートより取り、LB(amp) 3ml culture ・１６時間後、培養液1.5 mlを用いてプラスミド抽出 (エッペンドルフ社抽出キット使用) (このとき、別のプラスミドBの入った菌体についても同操作でプラスミド抽出) ・抽出プラスミドをA260とA280で定量 (個人計算ではなく、PCとの連結による測定・定量プログラムを使用) ・濃度は充分にあり(プラスミドBについても同様) 【プラスミドAの制限酵素チェック】 ・200ng分のプラスミドを、EcoRI,NotIでcutし、チェック (プラスミドBについても、制限酵素cutチェック) ・半量電気泳動 -------- ・プラスミドAが見当たらない →処理断片が見えない(1300bp＋ベクター) →切れ残りと思われる断片も存在しない ・同抽出キット使用のプラスミドBは切断確認 --------- ・抽出キットの不良品にあたった可能性もあるため(過去に経験あり)、残りの培養液で再度抽出、濃度充分、制限酵素処理するが、プラスミドAは存在しない・・ ・翌日、もう一度BANKより培養したものを用いて、抽出、定量、酵素消化するが、上記同。 【BANKからの画線培養と、colony direct PCR】 ・本当にプラスミドはないのか？？BANKから画線培養を行う ・生育コロニー5つを、colony direct PCR ・適切な位置に、増幅断片確認 以上が現在の状態です。 本日、この画線培養からcolony direct PCRにかけた5クローンのBANKから液体培養を行い、明日、プラスミド抽出して確認する予定です。 生育させたプレートや液体培地は全ての過程でLB(amp)であり、生育コロニーは全てamp耐性遺伝子をもつ菌であるはずなのに、プラスミド抽出でプラスミドAのみが消失してしまうのはなぜなのでしょうか？？使用したプレート、液体培地は、フレッシュなもので、ampがへたっていたとは考えにくいとおもいます。それぞれ、final 100 ug/mlのamp濃度になっています。 明日のプラスミド抽出でものが取れれば、問題自体は解決するのですが、いかんせん理由がわからないので、気持ち悪いのです。こちらでも、理由を考えてみたのですが、しっくり来ません・・・・ キットの不具合・・・といっても、プラスミドAに用いるもののみ、不良品にあたる確率はものすごく低いと思います。 何かご存知の方いらっしゃいましたら、教えていただきたいと切実に思っている次第です。長文になりましたが、よろしくお願いいたします。

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