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細胞周期同調−チミジンとp53の関係？ 削除/引用 No.4062-9 - 2007/09/10 (月) 18:34:27 - 桃 細胞周期の同調法の中で，チミジンによる2重処理法というのがありますが，以前このフォーラムの中で，使用する細胞のp53がintactのため，チミジンブロックによる同調は有効でないという一文がありました．これは，一般的な考え方なのでしょうか？いろいろ探してみたのですが，探し方が悪いのか，根拠となる資料が見つかりません．もし，論文などご存知の方がおりましたら，教えていただけますか？また，論文等ご存じなくても，チミジンの過剰処理とp53の関係をご存知の方がいらしたら教えていただけないでしょうか（チミジン処理で細胞が死んでしまうから？）．

(無題) 削除/引用 No.4062-8 - 2007/04/17 (火) 06:54:14 - CaP 可能性さん、ありがとうございました。 > もちろん、そちらの方がベターです。Mitoticでないやつが除けますからね。ただ、実験の目的にもよります。その細胞はノコダゾールで死なないので、Shake処理しなくてもMitoticに同調したものがかなり得られます（Flow の２重染色で判断すると。いくらくらいか覚えてない）。ただ、どうせ薬を除くのですから、軽くShake処理しない理由はあまりありませんよね。 > > 当然、どのくらい同期しているのかは、その後、Flow（最低、１重染色）で追跡すべきでしょう。> もっと処理が長い方がいいかも？ （これも時間をあらく振る。） 残念ながら使う予定の細胞はp53がintactのため二重チミジンは有効ではないらしいです。ということは、Mitotic Shake offはすべきですよね。どうせ同調するならば大多数を同調すべきだと思いますが、まあ、そこは本人に任せようかと思います。フローサイトはもちろん行う予定です。 うまくいかなければクローニング等をせざるを得ないでしょうが。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4062-7 - 2007/04/14 (土) 10:02:46 - 可能性 ＞16時間なら16時間後にMitotic Shake offでM期の細胞を集めた上で薬剤を遠心等で洗い、それでリリースと考えるのではないか、という内容でした。 もちろん、そちらの方がベターです。Mitoticでないやつが除けますからね。ただ、実験の目的にもよります。その細胞はノコダゾールで死なないので、Shake処理しなくてもMitoticに同調したものがかなり得られます（Flow の２重染色で判断すると。いくらくらいか覚えてない）。ただ、どうせ薬を除くのですから、軽くShake処理しない理由はあまりありませんよね。 当然、どのくらい同期しているのかは、その後、Flow（最低、１重染色）で追跡すべきでしょう。もっと処理が長い方がいいかも？ （これも時間をあらく振る。）

(無題) 削除/引用 No.4062-4 - 2007/04/14 (土) 08:32:29 - CaP 通りすがりさん、早速ありがとうございます。 > >自分はM期の同調に関してはMitotic Shake offが原則だと思っていたのです > >が、どうなんでしょうか? > ラボによりますね。薬剤が当たり前のところもあります。 > 言葉が足りませんでした、誤解を生む表現だったかもしれません。 ノコダゾール等の薬剤を添加して培地を置換しただけで細胞がM期に同調したと考えるのではなく、16時間なら16時間後にMitotic Shake offでM期の細胞を集めた上で薬剤を遠心等で洗い、それでリリースと考えるのではないか、という内容でした。 で、いかがでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.4062-3 - 2007/04/14 (土) 08:24:45 - おお > ノコダゾールを添加したまま16時間処理、と自分にとっては少々長時間と思える処理をしていて、同僚はそのまま薬剤を除けば同調からリリースされる、と受け取っているようです。 > 自分はM期の同調に関してはMitotic Shake offが原則だと思っていたのですが、どうなんでしょうか? よくつかわれて"いた"方法です。最近は細胞周期はほとんどたずさわっていませんのでよく分かりません。 "通りすがり"さんほど詳しくないのであまりいいアドバイスはできませんが、何年か前からcdk特異的なインヒビターが開発され出回るようになってきてます。なかには使えるものがあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4062-2 - 2007/04/14 (土) 07:57:04 - 通りすがり >ノコダゾールを添加したまま16時間処理、と自分にとっては少々長時間と思える >処理をしていて、同僚はそのまま薬剤を除けば同調からリリースされる、と受け >取っているようです。 難しいところですが、現在では少なくとも第一選択として割と頻用される方法である程度ならば受け入れられている方法であるといえます。 16時間も割りとよく用いられる時間ですね。 もちろんnocodazoleからのreleaseはcdc2の活性など かなり怪しい部分があるので、ある程度信頼性のある論文などの場合は、 他の同調法からのreleaseなども同時にdataとして出して 最終的な結論を述べるのが多いパターンでないでしょうか。 >自分はM期の同調に関してはMitotic Shake offが原則だと思っていたのです >が、どうなんでしょうか? ラボによりますね。薬剤が当たり前のところもあります。 自分の場合は薬剤によるartifactや、mitotic shake offによる物理的なダメージも考慮して、さらに非同調下での免疫染色などと組み合わせて 裏を取るやり方をしてます。

細胞周期の同調・M期同調について 削除/引用 No.4062-1 - 2007/04/14 (土) 06:55:55 - CaP 培養細胞における細胞周期の同調について質問です。 かなり前のことになりますが、HeLa S3細胞を用いて細胞周期に関わる事象の実験をしていました。その頃は、二重チミジン同調法やチューブリン重合阻害剤による同調を行うことで、ある程度特定の周期の細胞を濃縮して実験を行っていました。 最近、同僚があるタンパク質の細胞周期進行に対する影響を調べたい、ということでいろいろ調べたり、相談を受けています。 その中で、ノコダゾールによるM期同調のことをディスカッションしたのですが、とある論文の記述を見ると、ノコダゾールを添加したまま16時間処理、と自分にとっては少々長時間と思える処理をしていて、同僚はそのまま薬剤を除けば同調からリリースされる、と受け取っているようです。 自分はM期の同調に関してはMitotic Shake offが原則だと思っていたのですが、どうなんでしょうか? 最近の同調法も含め、どなたか御存知でしたらアドバイスいただけると幸いです。

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