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めんどくさいっすね〜 削除/引用 No.4133-8 - 2007/05/06 (日) 21:58:47 - ボブ みなさま おそらくinsertが大きいことによる組み替え等、あまりよろしくないことが起こっているのでしょう。 貴重なご意見を参考にやりなおします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4133-7 - 2007/05/06 (日) 21:31:07 - ひろ 大腸菌の中で組み替えが起こっているんじゃないんですかね？ インビトロジェンのStable3っていうコンピは組み替えしないようにできているらしいので、もしお持ちであればやってみる価値あるんじゃないかな？？

いるんですよね〜 削除/引用 No.4133-6 - 2007/05/04 (金) 01:30:57 - ポー 普段、15-20Kbのプラスミドの構築を行っている者です。 〜さんのおっしゃるような、single colony isolationをやっても、目的サイズのプラスミドをゲル抽してtransformationからやり直しても、maxiprepして泳動してみると、やはり数Kbのバンドが出現してしまうことがあります。 ・・・なぜだかいるんですよ、そういうタイプのプラスミドが。 私は、プラスミド固有のtopologyに因るものと考えています。 多くのmaxiprepのキットは、一言で言えば、大腸菌の粗抽出物からカラムで「最もclosed circularが多い画分」を取ってくる、という原理から成っていますが、元々のプラスミドのtopologyによっては、ある割合でclosed circular以外のものも混ざってしまうようです。 精製した混合物(15Kb&3Kb)のプラスミドを制限酵素で消化した結果、単一バンドになるか、または3Kbの方のバンドが薄くなるようでしたら、両者は同じプラスミドである可能性が高いです。 その場合、transfectionに使用することは可能です。 勿論、実験の精度によりけりですが、例えば、培養細胞で目的遺伝子を安定発現する用途の場合、要はゲノムに組み込まれればいいのですから、ベクターの構造は問題にはなりません。実際に、私も、混合物を遺伝子導入して安定発現株を取った経験があります。 尤も、私の場合、最初のmaxiprep精製で数Kbの影が現れた時点で、何も考えずに密度勾配遠心で取り直すことが多いです。 single colony isolationやら諸々のチェックするのと所要時間は変わりませんし、確実だからです。 何より、maxiprepには今まで痛い目に遭っているので、あまり信用していません。

(無題) 削除/引用 No.4133-2 - 2007/04/30 (月) 22:32:45 - 〜 使っているのはウイルスベクターのようなデリーションしやすいベクターではありませんよね。 それとベクターのコンストラクションの際に、oriとAmp耐性遺伝子は別々のフラグメントではないですよね。 1つのフラグメントであれば、3kbのセルフ？のほうが複製が早く、バンドが濃くなるはずです。 まずは、得られているコロニーをプレートに撒き直して、 シングルコロニーを取り直してみてはいかがでしょうか。 それで複数コロニーをミニプレップしても、同じ現象が見られるのならば、 コンタミではなくてデリーションの可能性が高いと思います。 もう少し手間をかける余裕があれば、 15kbのバンドを切り出して入れなおした方がはっきりするかもしれません。 デリーションならば、 培養温度を下げてみたり、 大腸菌株を変えてみると抑えられるかもしれません。 それと、念のため今使っているコンピと同じロットのものを LAプレートに撒いてみてはいかがでしょうか。

プラスミド?のコンタミ 削除/引用 No.4133-1 - 2007/04/30 (月) 21:54:08 - ボブ 実験がうまくいかず困っています。 目的遺伝子を大腸菌にtransform⇒single colonyのpick up⇒LA plate培養⇒LB培地(amp+)⇒maxiprep⇒電気泳動と実験したのですが、目的のvector(15kb)以外に3kbあたりに謎のbandが見えます。 ちなみに大腸菌はDH5αでメーカから買ったものを使っています。 目的bandの1/10程度の量なのですが何らかのplasmidかもしれずtransfection実験ができません。 maxiprepのkitに問題があるかと考えて全てのkitを新しくしてtransformからやりなおしたのですがまた奴が出ました。 また以前同じplasmidをmaxiprepしたときにはこの現象は起こりませんでした。 この現象は私の同僚にも起こりました。 私が考えたのは、二つで �@ampicillinは静菌性なので正しいplasmidをもった大腸菌がampを使い切り、隣の少量の生き残った菌が増えた。根拠として、巨大なplasmid(15kb)を持った菌なので実際に成長が遅い。その間に邪魔者が増えたのでは。 �Acompetent cellが既に何らかのplasmidを持っていたのでは? そこにもう一つ正しいplasmidが入り込んだ? どうでしょうか 皆様同様の現象は起こったことがありますか? 若輩者に助言よろしくお願いします

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