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(無題) 削除/引用 No.4142-6 - 2007/05/06 (日) 18:16:46 - raven 通りすがりさん、TSさん レスありがとうございました。 タンパク質Aとタンパク質Bの相互作用は今までに調べられていないので、それが分かれば、一歩前進ということになるのですが、現段階では可能性があるということだけです。 実は、以前に同様の実験を行ったのですが、その際はAに対応するバンドがレーン２にも出てしまったのです。ただ、IgGのバンドも出てしまい、果たして本当に目的のバンドなのか、怪しんでいました。 そこで、再度同じ実験を繰り返したところ、今度はレーン２にはバンドが出なかったということです。 自分でも混乱していて大変失礼いたしましたが、お二人のおっしゃるように、確かにマウス由来の抗体で免疫沈降したものを、ウサギ由来の抗体でウェスタンしても、IgGのバンドは検出されないはずです。 ここのところで、混乱していたようです。お恥ずかしい限りです。 Lysis bufferは、20mM HEPES, pH7.5/150mM NaCl/1mM EDTA/1% NP-40/Complete protease inhibitor coaktail (Roche) これに組織をホモジェネイトして、lysateを抗体と混ぜて４℃で４時間ほど混合して、ビーズを洗って、サンプルバッファーに懸濁、というかたちを取っています。 手順の説明が煩雑で申し訳ありませんが、バイオイラストレイテッドやその他のプロトコール集に載っている方法です。 ひとまず、AとBの相互作用がないという可能性も念頭に置きつつ、Co-IPがうまく働いていることを示すのが良いのかもしれません。 お忙しいところ、お付き合いいただき、ありがとうございます。また、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4142-5 - 2007/05/03 (木) 12:04:06 - TS まず読んでいて少し気になることが２つありましたので。 >少しおかしいなと自分で思うのは、転写後の膜ではレーン２にでもタンパク質の吸着が確認できるのに、ウェスタンでは何も検出されない、というところです。 これは、IPに使ったIgGが見えてるだけではないのですか？どの程度の量のタンパク質をCo-IPできているかにもよるかもしれませんが、私の感覚では、タンパク質Bと相互作用しているタンパク質がうまく落ちてきているとしても、パンスー染色で見えるほど落ちてくることはまれだと思いますけど。もちろんIgG以外のバンドが見えることはありますが、私はビーズとかに非特異的に落ちてきてると通常理解します。 >ここで、タンパク質Aとタンパク質Bが相互作用するなら、抗B抗体でIPしたサンプルのレーンにもタンパク質Aのバンドが出てくると予想されます。 しかし結果は、タンパク質Aのバンドも、IgGに対応するバンドも検出されませんでした。 組み合わせ的には、ImmunoblotではIgG(heavy, light chain)は見えなくて正解です。 本題ですが、Co-IPがうまく動いているという確証をとるのが得策ではないでしょうか？IP:タンパク質B,IB:タンパク質Bがうまくいっているとしても、Co-IPがうまくいっているという証拠にはならないと思います（これはやってますよね？）。そこで、たとえば、タンパク質Bと相互作用することが知られているタンパク質はないですか？それをImmunoblotすれば、Co-IPがとりあえずきちんと動いていると言うことになります。それでかつ、タンパク質Aが検出できないのであれば、AとBは相互作用していないか、条件（lysis bufferなど）を変える必要があると判断するのが良いのではないでしょうか？ ちなみに、どのようなLysis bufferとIP bufferを使っているのでしょうか？大丈夫だと思いますが、nativeの条件でやっていますよね？

(無題) 削除/引用 No.4142-4 - 2007/05/02 (水) 17:45:04 - 通りすがり >転写後の膜ではレーン２にでもタンパク質の吸着が確認できるのに、ウェスタン >では何も検出されない、というところです。 これはポンソーか何かでバンドが見えるということを言ってるのでしょうか？ 抗B抗体によるIPがうまくいってるなら当然Bに結合する因子がtransferされて きてますよね。 それはそれで抗B抗体によるIPがうまくいってるという解釈でよいのでは？ >ウサギ由来の抗体でIPしたものを、マウス由来の抗体でウェスタンしよう、とい >うのが間違っていたのでしょうか。 全然間違ってないですよ、というか一番IPで多く使われるやり方でしょう。 というより技術的にはまあ、 レーン2でもしバンドがでてたらpre-immuneの抗体でIPしてから抗A抗体で WBして、特異的な結合であることを示すべきではありますが、 今の時点でやることとしては今のやり方でそんなに問題ないですよ。 というかむしろひっかっかるのは、 Ａ−Ｂの相互作用は他の系などでも確認されているものなのでしょうか？ （たとえば同じメンブレンを抗B抗体でWBするとレーン1でバンドがでるとか） ぱっと読んで一番受け取りやすい解釈は AとBが相互作用してないという解釈なんですが。 それではまずいのかな？

(無題) 削除/引用 No.4142-3 - 2007/05/02 (水) 16:29:39 - raven 〜さん、レスありがとうございました。 このトピックにお付き合いくださって、恐縮です。 少し話を整理しますと、SDS-PAGEで以下のサンプルを泳動しました。 １：抗A抗体でIPしたもの(抗A抗体はマウス由来) ２：抗B抗体でIPしたもの(抗B抗体はウサギ由来) ３：IPしていないlysate これをPVDF膜に転写し、抗A抗体でウェスタンという具合です。 このとき、レーン１と３には、タンパク質Aに対応するバンドが検出されました。レーン１には、IPに使用した抗A抗体のバンドも確認されます。大体、５５kDaと３５kDa付近のところに出ます。 ここで、AとBの相互作用があるということで、レーン２にもタンパク質Aに対応するバンドが出ると予想されます。 ところが、このレーンは何も出なかったということです。 流しているサンプル量は、レーン１と２に１０μl、レーン３は５μlです。 レーン１と３に出るAのバンドの濃さ、太さは、ほぼ一緒でした。 少しおかしいなと自分で思うのは、転写後の膜ではレーン２にでもタンパク質の吸着が確認できるのに、ウェスタンでは何も検出されない、というところです。 ウェスタンの二次抗体は、HRP標識抗マウスIgG抗体を使っています。 自分でも少し混乱していて、的を得た回答になっていないかもしれませんが、何かお気づきの点などありましたら、またレスを頂ければと思います。

(無題) 削除/引用 No.4142-2 - 2007/05/02 (水) 15:34:29 - 〜 Lysateで検出出来てないので、系がおかしいのだと思います 並べて等量流したのでしたら、 AでIPしたレーンに合わせて焼いたら、lysateやBのレーンは見えなくてもおかしくないと思いますが、 何倍量を流しているのでしょうか ところでWBの時の抗A抗体は直接標識かgoatなどの抗体でしょうか IPで使った抗体が認識されない系か、バンドの位置が十分に離れているのですよね WBとIPを両方ともマウス抗A抗体でやっていて、 二次抗体に抗マウス抗体を使って、 IPに使った抗体を検出しているなんてことはありませんよね

免疫沈降の抗体と、ウェスタンの抗体 削除/引用 No.4142-1 - 2007/05/01 (火) 21:56:05 - raven たびたび、お世話になります。 ものすごく基本的なことのような気がして、恐縮なのですが、免疫沈降で使う抗体と、ウェスタンのときに使う抗体の組み合わせに関してです。 例えば、タンパク質Aとタンパク質Bがあって、それぞれに対する抗体があります。ただし、タンパク質Aの方はマウス由来、タンパク質Bの方はウサギ由来です。 今、抗A抗体と抗B抗体を使って、それぞれ免疫沈降をしました。これらのサンプルをSDS-PAGEにかけて、ウェスタンという具合に実験を進めます。 今回は、ウェスタンのときに使う抗体は、抗A抗体です。 IPにかけていないlysateをコントロールのサンプルとして、一緒にSDS-PAGEにかけています。 これを抗A抗体でウェスタンすると、まず、コントロールのレーン、そして抗A抗体でIPしたサンプルのレーンで、タンパク質Aに対するバンドが検出されます。 ここで、タンパク質Aとタンパク質Bが相互作用するなら、抗B抗体でIPしたサンプルのレーンにもタンパク質Aのバンドが出てくると予想されます。 しかし結果は、タンパク質Aのバンドも、IgGに対応するバンドも検出されませんでした。 ウサギ由来の抗体でIPしたものを、マウス由来の抗体でウェスタンしよう、というのが間違っていたのでしょうか。 以前に、同じ組み合わせで実験を行った時は、こんなことはなかったのですが、皆様はどうお考えになりますか？屈託のないご意見をお待ちしております。

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