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情報ありがとうございました 削除/引用 No.4168-8 - 2007/05/10 (木) 06:46:02 - メンブレン 投稿者です。親水処理してやってみようと思います。 貴重な情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4168-7 - 2007/05/09 (水) 14:10:15 - へろ イモビロンですか。 イモビロンは乾燥を推奨している部分があることは私も知っていますが、イモビロン自体を使った事がないので何ともコメント出来ません。すみません。 ブロット後の乾燥も、実はやったことがありません。私の場合、基本的にメンブレンは1〜3回で処分してしまうので、5回以上もはがしたメンブレンをどうこうしようとはあまり思いませんが、もしどうしても諦めきれないということであれば、私なら乾燥してしまったのならば親水化処理してやってみるかなと思った程度です。もしやるなら、メンブレンさんの言われているような感じでやってみると思います。 メーカーさんが乾燥を推奨しているということもあるので、単なる寿命かもしれませんね。

親水化処理は必須ではないです 削除/引用 No.4168-6 - 2007/05/09 (水) 11:42:03 - TS 他の方がおっしゃられるとおり、再度親水化処理をするというのが基本的、一般的なプロトコールかと思います。 一方で、あまり知られてない気もしますが、MilliporeはPVDFを乾燥させる方法を推奨している部分があります。 原理的には、乾燥させると、PVDF上でタンパク質がない部分には抗体が吸着しないので、ブロッキングが必要なく、時間の短縮になるとともに、バックグラウンドも抑えられる、というものです。 以下のページのusers manualを見れば、方法が詳しく書いてありますので、参考になれば幸いです。 P13くらいから見てもらえれば、わかると思います。 http://www.millipore.com/userguides.nsf/docs/p15372

もう少し詳しく教えていただけますか 削除/引用 No.4168-5 - 2007/05/09 (水) 11:28:17 - メンブレン PVDF (Immobilon-P) を使っています。親水処理というと、メタノール２０秒、水２分というやつでしょうか。 一度企業の説明会 (MilliporeかInvitrogenか忘れてしまいました) で聞いたことがあったのですが、詳しいプロトコールを忘れてしまったので、教えていただけると助かります（上記時間でよいのかどうかなど）。親水処理後は染色バッファー (自分の場合TBS-Tween 0.05%, 0.5% Skim milk) につけるので大丈夫でしょうか（トランスファーバッファーにつける必要はないと思いますし、今はバンドが見えないで困っているのでブロッキングは省略しようと思いますが）。それともブロッキング (5% skim milk) をしておいた方がよいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4168-4 - 2007/05/09 (水) 08:56:09 - へろ PVDFメンブレンなら、一度乾燥させると、また親水化処理が必要なのではないでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.4168-3 - 2007/05/08 (火) 23:52:52 - メンブレン 投稿者です。確かにブロットの寿命ということなのかもしれません。あまりにも突然にきれいさっぱり何も検出されなくなってしまったので、直前に起こったブロット乾燥と結びつけていました。乾燥なのか、寿命なのか、両方なのか、似たような経験のある人がいたらレスをくださるとありがたいです。 ウェスタンについては、ご指摘の通り、余ったサンプルでもう一度やり直そうとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.4168-2 - 2007/05/08 (火) 14:20:31 - そば リプローブは何度でも出来るわけでは無く、回数には限度があるはずですよ。 http://bio.takara.co.jp/catalog/Catalog_d.asp?C_ID=C1765 http://www.nacalai.co.jp/information/05-06/wb-strong.html 例として挙げますが、これらの市販のキットでもリプロービング可能回数は2回〜5回もしくは数度となってますよね。5回以上出来ただけでも、十分頑張っていると思いますが。 そういう意味でも、乾燥とは別問題という気がします。 （もしくはリプローブ回数と乾燥という二重の原因で抗原が急激に変性したり？） 仮に今のメンブレンを多少回復する手があったとしても、今のメンブレンに拘るのでは無く、再度ブロッティングからやり直しを検討された方が良いのではないかと思います。

乾燥させてしまったウエスタンブロットを復活させる方法 削除/引用 No.4168-1 - 2007/05/08 (火) 02:25:27 - メンブレン 非常に初歩的なミスですが、困っているのでもしも知っていたら教えてください。 乾燥させてはいけないと言われているウェスタンブロットのメンブレンを乾燥させてしまい、それ以後バックが上がるのではなく、抗体で染色してもバンドが見えなくなってしまいました。 抗体によるバンドが見られない場合、普通は１時間とか焼くとメンブレン全体が真っ黒になりますが、それすらも見られない状態です。（一次抗体の染色中に乾燥させてしまったのですが - 染色バッファーは0.5% skim milk/TBS-Tween 0.05% - 、ブロッキングが非常に強くなったような印象があります。） メンブレンはリサイクルキットを使って何度も (5回以上) 染色し直しています。乾燥させる前は順調に染色できました。乾燥後はアクチン抗体でも染まりません。 バックが上がるのならば分かるのですが、不思議です。

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