全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4172-14 - 2007/05/21 (月) 10:33:38 - Ｔak GEのものはDTTでも5mMくらいはいけましたね！？ありがとうございます。参考にさせて頂きます！！

(無題) 削除/引用 No.4172-13 - 2007/05/20 (日) 23:02:14 - 純ココア GEのNi sepharose FFを使っていますが、色が変化した覚えはありません。 確かこれくらいの濃度の2MEは使用可能になっていたと思います。 最近のNi樹脂は還元剤が大丈夫なものが多いような気がします。 ちなみにBio-Radのも大丈夫だったと記憶しています。

ありがとうございます。 削除/引用 No.4172-12 - 2007/05/20 (日) 13:12:59 - Ｔak ありがとうございます。 その濃度の還元剤を加えると、カラム樹脂が茶色に変色しませんでしたか？それでも問題ないのですかね？樹脂をダメにしてしまいそうで怖いのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.4172-10 - 2007/05/19 (土) 21:06:20 - 純ココア > ＞還元剤を入れると見事に改善されました > > とのことですが、濃度はどれくらいでしたか？参考までに教えて頂きたいのですが。 3年くらい前のことなのではっきりとは覚えていませんが、10-20mMの2-MEだったと思います。

ご報告 削除/引用 No.4172-9 - 2007/05/18 (金) 16:23:21 - こまった 遅くなりましたが、経過を報告させていただきます。 ６M Guanidineで変性させたら、上手く結合＆溶出できました。 ちなみに、2-MEでは駄目だったので、S-S結合ではない構造でマスクされていたんですね。 ところで、８M urea含有リン酸バッファーで可溶化（遠心後の上清を使用）したら、精製する前からタンパクが検出できませんでした。これって、可溶化されていないということですかね？確かに６M Guanidine含有リン酸バッファーを加えた細胞液はすぐに透明になって細胞が溶けたという印象でしたら、ureaの場合は、ずっと顕濁したままで、遠心後もpptが大きかったです。 ともあれ、Guanidineの系で上手く行きそうなので、これでやってみます。 アドバイス、ありがとうございました。

試してみます 削除/引用 No.4172-8 - 2007/05/14 (月) 17:45:22 - こまった 皆さん、いろいろなアドバイスありがとうございます。 とりあえず、Hisタグがマスクされている可能性を重視して、Guanidine or Ureaで変性、2-MEで還元の３つを試しています。週末頑張って今日は結果報告できるはずだったのですが、Westernで抗体をケチったせい（と思われる）で上手く結果が得られませんでした。トホホ。またご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.4172-7 - 2007/05/14 (月) 10:30:19 - Ｔak ＞還元剤を入れると見事に改善されました とのことですが、濃度はどれくらいでしたか？参考までに教えて頂きたいのですが。

(無題) 削除/引用 No.4172-6 - 2007/05/10 (木) 18:27:52 - 純ココア 以前バキュロで同じ現象に遭遇しました。 そのときは還元剤を入れると見事に改善されました。 おっしゃっているようにHisタグがマスクされている可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4172-5 - 2007/05/09 (水) 18:14:39 - A >SDSで変性させてNi or Co精製ってあまり聞きませんよね。 http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/Protein/Expression/QXP_QIAexpressionist/1024473_QXPHB_0603.pdf これはQiagenのNi-NTAのマニュアルですが、74ページの表によると SDSの様なanionic detergentsを使うのは避けたほうがよさそうですね。 多分Ni+と相互作用してしまうのでしょう。NP40については2%まで OKのようです。 >そういう場合は尿素やグアニジンで変性させれば露出するんでしょうか？ His-tagが内部に隠れている可能性が考えられる場合はグアニジンや尿素 で変性させてからNiカラムで精製したりします。

分子の内側ってことも？ 削除/引用 No.4172-4 - 2007/05/09 (水) 17:13:24 - こまった qさん、Yさん、アドアイスありがとうございました。 早速試してみます。 ところで、Hisタグが分子の内側に隠れてしまっているということもあるかもしれないと思い始めました。タンパクのC末にタグをつけているのですが、確かにC末は疎水性が高いアミノ酸がいくつか並びます。でも、6個の塩基性のHisがか完全に内部に入り込んでしまうでしょうか？リボンみたいにヒラヒラ〜っと出て来そうな気がするんですが。ともあれ、そういう場合は尿素やグアニジンで変性させれば露出するんでしょうか？尿素やグアニジンって、inclusion body中のタンパク質を可溶化するために使うという印象があるのですが。SDS-PAGEで検出できるのだから、SDS変性させれば露出することは確実だと思うのですが、SDSで変性させてNi or Co精製ってあまり聞きませんよね。

Dynabeads 削除/引用 No.4172-3 - 2007/05/09 (水) 15:56:01 - Y 自分はDynabeads TALONを使って非常に性能が良かったです。一度試されてみたら。

(無題) 削除/引用 No.4172-2 - 2007/05/09 (水) 01:03:05 - q 以前にHis-tagタンパク質をNP-40を用いてバキュロから精製していましたが、 Ni-NTAレジンを処理する前に、タンパク質溶液をPD-10カラムでリン酸バッファーに 置換していました。細胞由来の低分子を除くこともでき、かなり有効でした。

バキュロで発現させたHis-Tagタンパク質の精製 削除/引用 No.4172-1 - 2007/05/08 (火) 14:39:56 - こまった バキュロウイルス発現系を用いてHis-Tagタンパク質を発現させたのですが、上手く精製できません。細胞質に発現するタンパク質なので、NP40を含むbufferで細胞を可溶化し、Niカラムを使ったキットで精製したのですが、目的物がunbound fractionに来てしまいます。使ったキットはTOYOBOのMagExtractor HisTagです。抗HisTag抗体のウエスタンでdetect出来ているので、HisTagはちゃんと付いているはずなのですが・・・ NP40がキレーションの邪魔をするということはあるのでしょうか？（bufferにEDTAは入れていません）バキュロ発現系でHis-Tag精製されている方のノウハウをお聞かせいただけるとうれしいです。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---