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お願いします。 削除/引用 No.4219-6 - 2007/10/08 (月) 16:03:18 - はるこ phosphatase　inhibitor　bufferを作りたいですが、肝心な1mMNa3VO4を1mMまたはNaVO3を1mMをどうやって作りますか？手元にNaVO3がありますが、アンモニアにしか溶けないみたいです。細胞にアンモニアの影響は与えないでしょうか？教えてください。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4219-5 - 2007/05/17 (木) 14:03:51 - ptp 通りすがり 様 >それぞれの構造と、リン酸化された場合のチロシンの構造を考えてみてくだ>さい。おのずとわかると思います。 なるほど、分かりました。 このたびはご助言いただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4219-4 - 2007/05/17 (木) 10:41:56 - 通りすがり >実際、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムと比較して、phenylphosphateは阻害 >効果が高いのかが気になるのですが、 それぞれの構造と、リン酸化された場合のチロシンの構造を考えてみてください。おのずとわかると思います。

なるほど・・・ 削除/引用 No.4219-3 - 2007/05/16 (水) 21:55:28 - ptp 通りすがり　様 ご教授、ありがとうございます。 >阻害剤として、強力な方法を知りたいと思い、投稿させて頂きました。 >一番手っ取り早いのは阻害剤の濃度あげてみることです。 >組織のサンプルだと培養細胞の10倍とか100倍入れてる例は結構あります。 これにつきましては、すぐ取り掛かれそうなので、試してみようと思います。 >phenylphosphateを用いる阻害方法 >phenylphosphateを大量に添加して、リン酸基を基質とする >脱リン酸化酵素などをトラップさせとく意味で加えてるんだと思います。 >加えなくてもそんなに影響でたことないですが、もしやるなら >最終濃度1~10mMぐらいでsampleに加えてみてください。 トラップさせるということでしたら、リン酸バッファーにphenylphosphateを添加させる方向で検討してみようと思います。 実際、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムと比較して、phenylphosphateは阻害効果が高いのかが気になるのですが、何かご存知でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4219-2 - 2007/05/16 (水) 11:54:25 - 通りすがり >阻害剤として、強力な方法を知りたいと思い、投稿させて頂きました。 一番手っ取り早いのは阻害剤の濃度あげてみることです。 組織のサンプルだと培養細胞の10倍とか100倍入れてる例は結構あります。 チロシンホスファターゼの阻害剤なら他にSodium Gluconateなど ↓にまとめられてるので参考にすればよいでしょう。 http://www.cosmobio.co.jp/support/technical/tech_CBC_20050330/tech_CBC09_20050330.asp それとチロシンの脱リン酸化をするのは何もチロシンホスファターゼだけでなくDual specific phosphataseとかAlkaline phosphataseやAcid phophataseの一部も注意したほうが良いときがあります。 実際各社から販売されてるカクテルなどはチロシンホスファターゼ阻害剤と 名前はなってますが、alkaline phosphataseの阻害剤なども入ってることがよくあります。 >phenylphosphateを用いる阻害方法 phenylphosphateを大量に添加して、リン酸基を基質とする 脱リン酸化酵素などをトラップさせとく意味で加えてるんだと思います。 加えなくてもそんなに影響でたことないですが、もしやるなら 最終濃度1~10mMぐらいでsampleに加えてみてください。

脱リン酸化の阻害剤 削除/引用 No.4219-1 - 2007/05/15 (火) 20:46:15 - ptp マウス脳の可溶化液とGST融合タンパク質とでGST pull-down assayを試みております。 GST融合タンパク質はチロシンリン酸化を予めしておきます。マウス脳可溶化液と反応させると、このGST融合タンパク質の脱リン酸化が著しく、苦難しております。もちろん、このGST融合タンパク質が脱リン酸化されやすいタンパク質という可能性もあると思います。 チロシンフォスファターゼの阻害剤として、Na3VO4を1mMで使用しております。 何か有用な解決策はございませんでしょうか。阻害剤として、強力な方法を知りたいと思い、投稿させて頂きました。 また、phenylphosphateを用いる阻害方法があると聞いたので、今、それを調べているところですが、何かご存知の方は居られますでしょうか。 宜しくお願い致します。

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