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サザンのバンド 削除/引用 No.4314-11 - 2007/06/15 (金) 10:04:49 - さやか Jackieさん、ありがとうございます。 サザンのバンドは16kbです。カセットと5'アームを含めるとどうしても大きくなってしまいました。でもバンドはHomoの固体で濃く、Heteroで少しうすく、WildではNegativeです。サイズが大きいので断言はできませんが、見る限りバンドは1本に見えます。 そうですか、やっぱりLacZ（−）なら真っ青にはなりませんか・・・。テクニカルな問題（私の腕のなさ）なのかなぁ。MOさんやJackieさんのプロトコルを参考に、また頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.4314-10 - 2007/06/14 (木) 12:43:08 - Jackie サザンのバンドの大きさはどれくらいですか？ Homoの固体で濃く、Heteroで少しうすく、WildではNegativeですよね。 サザンのバンドが一本で、ちゃんとGelでSeparateされているのなら、余計なLacZの挿入はないのでしょう。 E10.5のWild-typeでも真っ青に染まるようでしたら、LacZの異所的発現の可能性が大なのですが。ちなみに、普通E14.5でもLacZ（−）なら真っ青には染まりません。体の奥のほうがなんとなく染まっているような感じです。切片にすると、非特異的な染色の場合、細胞間が染まって（沈着している）いるのがわかります。

バック 削除/引用 No.4314-9 - 2007/06/14 (木) 02:58:36 - さやか Jackieさん、ありがとうございます。SucroseでEmbryoが多少透明化されるとは存じませんでした。面白いですね！Wild Typeは、染まらない個体は全く染まらないのですが、全身真っ青になるのもあります。つまり個体差がおおきいのです。細胞が染まっているのかどうか、一度切片を作ってみたいと思います。 LacZが別の場所にも入ってしまっていないかは心配になって、LacZ内にプローブを作ってサザンした事があります。LacZカセットのすぐ3’側と、5’アームのすぐ外側で切れる制限酵素で切断したところ、予想される位置にバンドが一本だけ出ました。これでも別の場所に入ってしまっている可能性はあるでしょうか？ ちびたさん、GAのみの固定で結果はよくなりましたか？残念ながらわたしのは、あんまり変わりませんでした・・・。せっかくMOさんが親切に教えてくださったのに、なんだか申し訳ないです。おたがい、がんばりましょう！

(無題) 削除/引用 No.4314-8 - 2007/06/13 (水) 22:13:31 - Jackie 基本的には、さやかさんの染色法で染めています。 NP-40とともに、Detergentとして0.01% deoxycholate (DOC)を入れています。 X-galのFinalは0.5mg/mlで染めています（X-galは高いので）。4mg/mlは少し濃度が高すぎるかもしれません。 固定は20-30分やっています。 洗浄は30分×3回（Rocking) 染色は、37℃一晩していますが、Wild-typeが青くなったことはありません。 染色後、洗浄は洗浄液で30分×3回（Rocking)、20% Sucrose/PBS ×1回 それからOCTにマウントして凍結します。 20% SucroseでEmbryoが多少透明化されるので、実体顕微鏡下で染色が見やすいです。 パラフィン切片を作成するには別の方法があります。 E10.5でもバックがありますか？ E14.5は組織が厚いのでバックがあるかもしれませんが、細胞が染まっているわけではないでしょう。Wholeで染めた後、切片を切ってみれば染まっていないことがわかります。 もしテクニカルな問題でないとすれば、そのマウスを疑う必要もあると思います。Homologous recombination以外に、LacZがどこか（ActiveなSite）に挿入されてしまっていて、一見Wild-typeでもUbiquitousな発現が見られるとか。この場合は、LacZを認識するPCRで検出できます。

LacZの固定 削除/引用 No.4314-7 - 2007/06/05 (火) 11:06:56 - ちびた MOさん、私のとんでもない質問にご丁寧にお答え下さり、本当にありがとうございました。今朝、サンプル出ましたので、御教示頂いた通りに固定しております。結果は・・・近いうちに是非喜んでご報告できるといいのですが（＾＿＾）

(無題) 削除/引用 No.4314-6 - 2007/06/04 (月) 22:49:22 - MO 前述のプロトコールは、うちのラボで長年出回っているもので、胎仔サンプルからアダルト・マウスの臓器や固定後脱灰した骨でも染色可能なものです。 組織像を保つためにLaZ固定する前に短時間フォルマリンやPFAで固定することも可能ですが、長過ぎる固定はLacZ活性を殺してしまうこともあるようです。 GADはシグマの２５％溶液を５０ml中0.4ml使用しています。１M−MgCl2は50ml中5.1ml使用しています。これはあくまで一つのプロトコールであって、他にも様々な組成があるので、検索して試してられたらいいと思います。 EGTAはNaOHで滴定しながら250mM、PH7.3あるいはPH8を作成し、使用しています。

LacZの固定 削除/引用 No.4314-5 - 2007/06/04 (月) 15:42:46 - ちびた 横やりですみません、私もLacZ染色で苦しんでいます。MOさんのGAのみの固定はとても魅力的でやってみようかと思います。そこで素人質問でお恥ずかしいのですが、2.5M EGTAって？EDTAではなく？作ったことないのでちょっとわかりません。無知を露呈して苦笑ものなんでしょうが、なにせ私の求めていたトピックだったので、御教示頂ければ幸甚でございます。また、Ｍｇは最大5.1ｍｌ加えるということなのでしょうか。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4314-4 - 2007/06/01 (金) 11:33:06 - MO GADはグルタルアルデヒドのことです。４℃の場合ゆっくり反応させて呈色させるので、バックグラウンドは少なくなります。O/Nに出来るかどうかは、目的の遺伝子の発現強度によると思います。３７℃では呈色時間が短縮しますが、染色具合が粗くなることがあるようです。以上は周囲のやっている方法ですが、私の場合はしっかり固定をし室温で随時染色具合を確認しながら、染色をストップしています。

ありがとうございます 削除/引用 No.4314-3 - 2007/06/01 (金) 11:01:11 - さやか MOさん、ありがとうございます。 確認ですが、GADはグルタルアルデヒドですか？ 手抜きしたいなら４℃、ということはo/nでしょうか。4℃の方がバックグラウンドが下がりますか？

(無題) 削除/引用 No.4314-2 - 2007/05/31 (木) 12:30:05 - MO 固定のステップは、一晩４℃にてPFAやフォルマリンを使用せずに行っています。その方がLacZ活性を保持し組織に固定液を浸透させる上で、いい感触が得られています（組織によって違いますが）。様々なレシピがありますが、私の使用している溶液の組成は、 0.4%GAD 1M MgCl2/100ul-5.1ml 2.5M EGTA(PH8) PBSで総量50mlです。 洗浄はPBS液でリンスするのみです。 そして染色はX-galも含んだ染色液で 20 mM K4Fe(CN)6o3H2O/PBS 250 μl 20 mM K3Fe(CN)6/PBS 250 μl 1 M MgCl2 1 μl 2% X-gal 50 μl PBS to 1 ml 室温で数時間から一晩、急ぐようなら３７℃、手抜きしたいなら４℃で実施しています。 染色程度にばらつきがあるようならば、固定後凍結切片を作成してスライドで染色すれば、詳細がより把握出来ると思います。

LacZ染色 削除/引用 No.4314-1 - 2007/05/31 (木) 10:19:15 - さやか 最近、ようやくノックアウトマウスが得られました。カセットにIRES-LacZをを入れているので胎児（E10.5, E14.5)を染めています。しかし一つのチューブで一緒に反応させた同腹の胎児には野生型でも全身真っ青に染まる個体があり、かといえばヘテロやNullでも全く染まらないのもあり、困っています。 わたしが今やっているプロトコルを下記しますが、どのように条件を変えるべきか（固定法、反応時間、温度、薬物濃度など）が分からないんです。 LacZカセットが動いていないのかも知れないんですけど、LacZ染色をあきらめるとしてもどうやって動いていないと判断するのかも分かりません。 どなたか、ぜひ助けてください！ 固定液 2% 　formaldehyde 0.2% glutaraldehyde 0.1% NP40 1xPBS, pH7.4 室温で10分 洗浄液 1xPBS, pH7.4 0.02% NP40 10分×3回 前処置 10x b-Gal soln (Xgal-) (stock in dark at RT or 4℃） 5mM K3Fe(CN)6 5mM K4Fe(CN)6 2mM MgCl2 1xPBS, pH7.4 暗所、室温で1時間 X-galをFinal 4mg/mlになるように加える。 暗所、室温で数時間様子を見ても青くならないので、37℃に（暗所）。一晩おくと半分くらいの個体が青くなりました。

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