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(無題) 削除/引用 No.4330-8 - 2007/06/05 (火) 02:48:03 - リコンビナント すみません。補足です。 目的タンパク質はかなりの部分不溶性分画にあります。 可溶性分画にも出てくるのでそちらは無視して、パワープレーで大量に培養して可溶性分画からタンパク質をとりました。 また、目的タンパク質は大腸菌に多少毒性があるらしく、Basalの発現を抑えるためグルコースを添加して培養を行っています。 こういったことがタンパク質の分解に関与するのでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4330-7 - 2007/06/05 (火) 02:38:55 - リコンビナント 皆様 アドバイスありがとうございます。 その後GST抗体を用いてWesternを行ったところ、やはり複数のバンド（目的タンパク質よりも小さい）が見られました。 どうやらタンパク質が分解されているようだと思っています。 すでに１８℃で7時間、IPTGも0.1 mMなので、これ以上穏やかに発現させることができるのかわからないのですが、逆に37℃で短時間に発現させたほうが分解が抑えられるということもあるのでしょうか？ 前回記載し忘れてしまいましたが、大腸菌はBL23(DE3)を使用しています。 精製の過程で凍結させないほうが良いというご指摘をいただきましたが、現在超音波破砕ののち、大腸菌の破壊を助ける目的で-70℃で一度凍結しています。これは省いたほうがよろしいでしょうか？ 現在pMALベクターのコンストラクトも作成中です。 こちらでうまく分解されないものができればよいと期待しているのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.4330-6 - 2007/06/03 (日) 00:01:33 - PAGE シャペロンにしては、やや大きいような気もしますが、アグっている 可能性は否定できませんので、以下のサイトを参考にされても良いかと 思います。シンプルですが、かなりシャペロン落としに効果があります。 http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/faq/chm/aff_fp.asp

(無題) 削除/引用 No.4330-5 - 2007/06/02 (土) 23:33:41 - Boston 私もシャペロンの可能性が高いと思います。経験上、培養温度を１８℃（もしくは室温）にするとリコンビナントの発現量を抑えることができるので、inclusion body の形成などシャペロンの過剰な関与を減らす事ができると思います。なお、IPTG 濃度と反応時間を一度検討されるのが良いかと思いますー10 mL スケールで。

(無題) 削除/引用 No.4330-4 - 2007/06/02 (土) 02:18:07 - mimi おそらく130kDaの高分子量タンパク質ですから、 分解産物または発現不良の可能性が大きいと思います。 B株由来の宿主を使って、Protease Inhibitorを入れて、 下記の方が言われるように、低温で迅速に精製するのが良いと思います。 あと以前にも書いた気がしますが、C末とN末にアフィニティの違う タグをつけて２段階で精製するのもお勧めです。 130kDaでN末はGSTですから、C末にHis-Tagなり、Strep-TagIIなり 、比較的小さなやつを付けると良いですね。あとは部位特異的プロテア ーゼのサイトを入れて、溶出に使うのも特異性をあげるのに便利です。 ただ、まずはPull-downなどにシングルバンドが必要なのか確認する 方が先かもしれません。100 kDa, 80 kDa, 75 kDaに相手のタンパク質 が被ってないならば、慎重にネガコンを設定して、そのまま使用できるか もしれません。

(無題) 削除/引用 No.4330-3 - 2007/06/01 (金) 23:29:59 - 名無し その100K 80K 75K の余計な蛋白質は分子量を考えると分子シャペロンみたいな蛋白質かもしれない。リコンビナント蛋白質やってるとよくある。元々量が多い蛋白質だし、外来蛋白質の過剰発現によるストレスで発現が誘導されていればさらに増えるから目的の蛋白質より目立つ事も珍しくない。ふつうはフォールディングが完了すれば離れていくけど、発現させたリコンビナントのホールディングがいまいち上手くいかないとか、発現量多すぎとかで、目的の蛋白質にがっちりくっついたまま（塩濃度あげるとかTritonで洗うとかのレベルではとれない）になって一緒に精製されてくる。対策としてはリコンビナントをカラムで精製する時、くっつけたあと、カラムをMgCl2とATPを含むbufferでよく洗って、それからリコンビナントを溶出するということをよくやる。MgとATPは分子シャペロンの基質（この場合リコンビナント）からの解離を促進する方向に働くので。この問題はmethodの論文とかにはよく取り上げられているので調べてみて下さい。 ２つめの可能性は分解。プロテアーゼ阻害剤Mixでもある程度抑えられるけど、、できる限り低温（1〜４Cくらい）を維持して、できるだけ迅速に細胞破砕から精製まで一気にやってしてしまうのがじつは一番効果的。途中で凍らせたり長時間止めたりしない方がいい。

(無題) 削除/引用 No.4330-2 - 2007/06/01 (金) 23:15:50 - gene 基本的すぎて能がないように思えるかもしれませんが、、、ゲルクロマト、HPLCなどでサイズフラクションをとる。

リコンビナントタンパク質の純度を上げる方法 削除/引用 No.4330-1 - 2007/06/01 (金) 22:47:58 - リコンビナント はじめてリコンビナントタンパク質を作っています。 pGEX vectorでGST-tagのついたタンパク質をつくりました。 GE health careのGlutathione Sepharose 4 Fast Flowで精製したあとに PierceのDailysis casettesを使って透析をovernigntで行っています。 その後、MilliporeのCentriplus（YM-100)を使って濃縮しています。 タンパク質の発現誘導条件は2% EtOH含有LBで、IPTG 0.1mM、18℃で7時間培養しています。 精製過程では2-ME(beta-メルカプトエタノール）とPFBを加えています。 目的のタンパク質はGSTも含めて130 kDa程度なのですが、ゲルを染めてみると目的タンパク質のバンドが一番濃いものの、100 kDa, 80 kDa, 75 kDaの位置にそれなりに濃いバンドが出てしまいます。 おそらく目的バンドは全体の50%程度の濃さだとおもいます。 Pull-downやOverlay assayに使用したいので純度を上げたいのですが、良い方法を教えてください。 どなたかご存知の方、是非助けてください！

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