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(無題) 削除/引用 No.4335-8 - 2007/06/04 (月) 15:47:22 - 関西人 Digoxigeninプローブでノーザンをしていますが、5回くらいはリハイブリできています。当研究室のプロトコールはDIGマニュアルに載っているものをそのまま、採用しています。 使用するメンブレンによって、使いにくいものがあります。ロシュのメンブレンが一番分厚い（頑丈？）で使いやすいような気がしました。他のものはすぐにヘロヘロになってしまった。

(無題) 削除/引用 No.4335-7 - 2007/06/04 (月) 11:19:37 - gene これまた失敬

(無題) 削除/引用 No.4335-6 - 2007/06/04 (月) 10:51:00 - 〜 すいませんcharged menbraneではなくて、churchハイブリダイゼーションバッファーです。 RIでやっていましたが、バンド1個のシグナルが数十kカウント位で、 いくら洗っても、数千くらいにまでしか落ちませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4335-5 - 2007/06/04 (月) 09:47:50 - gene 経験上、2,3回くらいなら容易だと思います。それより多くなるとものによっては出来る、くらいでしょうか。 簡単なのは、沸騰した水、または0.1%SDSに入れて、冷めるまで放置するという方法です。 私はこのところDIG, 化学発光でやっていますが、この場合、deprobingは75% formamide/10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/1%SDS, 68℃、30 min 2回を常法としています。 でも、どうしても完全にはdeprobe出来なかったり、blotの劣化ということは起きますので、あらかじめどういう転写産物が検出されるかということが分かっているなら、シグナルが弱いものから、また産物のサイズがなるべく重ならない組み合わせでprobingする、といったことを考慮します。産物のサイズが重ならないなら、同時にprobingするのも手です（たとえば目的のターゲットのprobeとinternal control用のprobeなど）。 RI probe（32P）でdeprobeが完全ではないときは、放射活性が減衰するまで待つのもありです（気が長いですが）。 〜さんの、non-charged membraneではdeprobe出来たけれど、chargedでは出来なかったというのは、おそらくnon-chargedではprobeだけでなくブロットされたRNAごとはがれていっているのだと思います。

DIGじゃなくても 削除/引用 No.4335-4 - 2007/06/03 (日) 23:06:38 - ななし direct labelling Kit使ってましたが、メーカーのマニュアルに載ってました。 暖かい1%かなんかのSDSで1h（たぶん）インキュベート→95だか100％だかのエタノールで洗う感じのプロトコールでした。 現在使ってるlabbelingシステムのメーカーに聞いてみてはいかがでしょう？ 膜が何回使えるかは、扱いの丁寧さによるところもあると思います。 私が持っているマニュアルでは3回程度でそれ以降は微妙です的な感じだったと思います。 私が2-3回使ったときは問題なかったです。

(無題) 削除/引用 No.4335-3 - 2007/06/03 (日) 15:18:41 - パンタ DIGシステムをお使いであれば、RocheのDIGアプリケーションマニュアルに詳しく載っています。　彼らが言うには、アクチンの検出ならば14回まで行えたそうです。 http://www.roche-biochem.jp/products/molecular_biology/dig/dig-prima/index.html 僕が行ったときは、少なくとも3つの異なるプローブでは検出に成功しました。ただ、それぞれのバンドに定量性があるかどうかについては疑問が残ります。

(無題) 削除/引用 No.4335-2 - 2007/06/03 (日) 12:07:13 - 〜 バイオダインBでデンハルトでハイブリさせた場合、 　0.5%SDSを沸騰させたものをかけて、 　100℃でインキュベート30分くらい を3回位やると、シグナルがなくなりました。 BAS2000で一晩挟んでシグナルが無いことを確認してから、 3~4回は使いまわしていました。 チャーチではシグナルが強すぎて、デプローブ出来ませんでした。

ノーザンブロットのメンブレンの使い回し 削除/引用 No.4335-1 - 2007/06/03 (日) 11:42:44 - 熊さん こんにちは。 現在ノーザンブロットを行なっています。 使用できるサンプルの量が少なく、 なるべく節約して使っていきたいのですが、 「脱プローブをすればメンブレンを繰り返し使える」 という話を耳にしました。 これは大体どのくらいの回数が使えるのでしょうか？ できれば方法などもご教授いただけたらと思います。 よろしくお願いいたします。

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