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(無題) 削除/引用 No.4339-9 - 2007/06/05 (火) 17:26:40 - 名無し 尿素とか塩酸グアニジンでジスルフィド結合が切れる（還元される）仕組みがわからないのでなんで切れるか教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.4339-8 - 2007/06/05 (火) 13:54:18 - 純ココア 私も変性剤のみでS-Sは切れないと思います。 あかねさんのおっしゃるように今回は可溶化のところでSSは考えなくてよいと思います。菌体内発現です。 封入体は一様ではないので、なんでもかんでも強い変性剤で溶かせばよいという訳ではありません。 培養速度や温度などで凝集度（ニュアンス伝わりますか？）が変わってきます。 ゆるい条件で可溶化できるのならば、それにこしたことはなく、 そこからrefoldingに持っていった方が良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4339-7 - 2007/06/05 (火) 13:46:19 - Ｔak S-S結合を切断するため、いつもDTTを加えています、私は。

(無題) 削除/引用 No.4339-6 - 2007/06/05 (火) 11:08:38 - あかね 皆さん、いろんなご意見有り難うございます。 結局、5M Ureaでは完全に溶解できなかったので、6M Ureaにするとかなり改善されました。今はrefoldingしている途中です。 ちなみに、私は変成剤のみではS-S結合は切れないと理解しています。 今回の場合は大腸菌で発現させていますので、もともとSS結合の心配はする必要がないですが。

本当ですか？ 削除/引用 No.4339-5 - 2007/06/05 (火) 10:46:37 - かすが 尿素やグアニジンでS-Sが切れるのですか？ 切れないとずっと信じてました。かなり焦ります。

(無題) 削除/引用 No.4339-4 - 2007/06/05 (火) 08:53:44 - pQE30 以前、封入体形成により悩んだことがありました。その時は８ＭUreaで可溶化後、封入体を精製し、その後グアニジンで可溶化して純度９０％以上の精製品をえました。 活性のあるタンパクが御希望との事ですが、御存知の通りUreaでもグアニジンでもS-Sは切れてしまうので、立体構造は変わってしまいます。S-Sが少ない場合ならばリフォールディングにより活性が回復したことがありますが。

(無題) 削除/引用 No.4339-3 - 2007/06/04 (月) 12:31:07 - 名無し 尿素は濃度がかなり高くないと十分な変性効果が発揮できないと前に習った。だから水に溶けるギリギリの8Mを使ってる。本とかにも8M尿素と書いてあるのよく見る。だから５M尿素がどのくらい可溶化できるのか分からない。だから5Mでだめなら濃度あげればいいと思う。あたりまえだけど蛋白質濃度高いと溶けにくいから、液量増やして蛋白質濃度が低くなるようにするとある程度改善されるかも。論文には普通そこまで書かないから、その辺の条件がすごい違っていて溶けにくいかもしれない。 グアニジン塩酸塩なら5〜６Mくらいで尿素の8Mと同じくらいの変性効果あると聞いたことがある。ので尿素の代わりに適当なバッファにグアニジン塩酸塩とかしてpH調整して使ってみるにもいいかも。どうせ５M尿素でもなんでも結局変性させるのだし取りあえずしっかり溶かせるもので透析で抜けるものを使うのが一番ではとか思う。

(無題) 削除/引用 No.4339-2 - 2007/06/04 (月) 12:07:44 - 純ココア > 完全には溶けきれていない様なので、どうしたものかと思っています。 > ちなみに、今回は同じタンパク質を精製したという論文を参考におこなっております。 うまくいっている論文があるならその通りにやるのがベストではないでしょうか。refoldingのところで頑張るのは非常に危険だと思います。それが目的なら別ですが。。。 完全には溶けきれていないということですが、それでも十分な量がとれるのではありませんか？ 逆に完全に溶かす条件にすると巻き戻らなかったり、巻き戻ったとしても活性がなかったりということになりかねません。

封入体の可溶化方法 削除/引用 No.4339-1 - 2007/06/04 (月) 11:48:52 - あかね いつもお世話になっております。 大腸菌で発現させたタンパク質を精製しようと思っています。 最終的な目的は活性を持ったタンパク質を精製してくることです。 大腸菌に発現させたところ、1x PBS/1% TritonXには可溶化せず、沈殿に目的タンパク質が検出されました。封入体になっているのだろうと思い、その沈殿を 5M Urea/1% TritonX/10% Glycerol/50 mM NaClに可溶化させようと思っています。（その後、refoldingさせようと思っています） 今回の様に、沈殿からタンパク質を可溶化させるさいは皆さんどのようになさっていますか？ 私は沈殿を5 M urea溶液にケンダクし、ソニケーションをかけています。 完全には溶けきれていない様なので、どうしたものかと思っています。 ちなみに、今回は同じタンパク質を精製したという論文を参考におこなっております。その論文では5M Ureaに可溶化させたと書いてあったのでその濃度からスタートしております。 よいアドバイスがあればお願いします。

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