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インサートの入ったプラスミドに入りません。 トピック削除
No.4342-TOPIC - 2007/06/04 (月) 14:54:19 - プラスミド
pYES263というベクターを使い、NcoTとEcoRTでカットし、ライゲーション後、大腸菌に形質転換しているのですが、インサートの入ったプラスミドが得られません。

別のインサートを同様に形質転換させると、インサートの入ったプラスミドが得られるのですが、目的のDNAを入れようとすると何も入っていないプラスミドばかりが取れます。

これは目的のコンストラクトが大腸菌に悪さしているということなのでしょうか？それと何か解決方法があればぜひ教えてください。
　
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(無題) 削除/引用
No.4342-2 - 2007/06/04 (月) 17:03:58 - A
あまり参考にならないかもしれませんが、私の個人的な経験からすると
２つの可能性が考えられます。

１．インサートが翻訳されていてその蛋白質が大腸菌にとって毒性を
　　持つため大腸菌が生えてこない。

解決方法としてはプロモーターの働きを抑える蛋白質を発現する
プラスミドを同じ大腸菌に形質転換する。私の研究室ではQiagenの
ｐQEシリーズを使っているのでその場合にはpREP4を共存させます。
詳しい理論に関しては以下のサイトの１６ページを参照してください。

http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressUACloningKit_EN

同じようなシステムが使えるかどうかは使ってるベクターの販売元に
相談してください。


２．使っているインサートが偶然非常に入りにくい。

この場合はライゲーションサイトを変更したり、ベクターを変更する
などして対応するしかないかもしれません。

とにかくまず１．の可能性があるのかどうか切り分けてください。

インサートの入ったプラスミドに入りません。 削除/引用
No.4342-1 - 2007/06/04 (月) 14:54:19 - プラスミド
pYES263というベクターを使い、NcoTとEcoRTでカットし、ライゲーション後、大腸菌に形質転換しているのですが、インサートの入ったプラスミドが得られません。

別のインサートを同様に形質転換させると、インサートの入ったプラスミドが得られるのですが、目的のDNAを入れようとすると何も入っていないプラスミドばかりが取れます。

これは目的のコンストラクトが大腸菌に悪さしているということなのでしょうか？それと何か解決方法があればぜひ教えてください。
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