本来、Northern hybridizationは、exon-intron構造が定かになっていない遺伝子であっても、クローニングされたゲノムDNA断片をプローブにして転写産物を解析できるという手法ですから、プローブの設計にクリティカルな制限はないと思います。
どの部分を使ったらいいかというより、specificな配列かどうか、crosshybridizationしないかどうか、のほうが大事ではないでしょうか。
cDNAクローンがあればそれをそのまま使うのが感度の上で一番いいと思いますが、反復配列が含まれている場合はそこをはずすべきでしょう。poly A tailもcrossするかもしれませんが、私の経験では、そのままでも問題ないようです。通常cDNA合成の過程で、せいぜい20 ntくらいにpoly Aは短くなっているせいかもしれません。
＞あと、プローブはどのくらいの長さにすればよいのでしょうか。
プローブの長さというと、プローブのcoverageのことか、断片化したプローブの平均鎖長のことか、どちらにも取れますが。coverageに関していえば、長ければ長いほど感度が良くなります。鎖長に関しては、ラベルの方法や処理の仕方でどのようなものが出来るかが異なってきますがcoverageは大きい方がいいけれど、平均鎖長は数百bpくらいが良いでしょう。
ラベルの方法、DNAプローブにするかRNAプローブにするか、二本鎖プローブにするか一本鎖プローブにするか、というかという選択はどうなっているのでしょう。それによってラベルに適したプローブの長さも変わってきますよ。 |
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