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gcクランプ付きプライマーのPCR増幅効率 削除/引用 No.4349-3 - 2007/06/06 (水) 11:51:31 - みな アドバイスありがとうございます。 確かに私も以前から増幅効率が若干落ちるかなという感覚はあったのですが、今回のようにほぼ全く増えないといってもいい状況は初めてなのでとまどっているのです。（gcクランプなしだと35サイクルで増幅してアガロースゲルに流してバンドがきちんと見えるのですが、gcクランプありだと全く見えません。この産物をテンプレートにしてもう一度35サイクル回すとやっとうっすら見えるようになります） gcクランプがついていてもプライミングする部分の塩基配列は変わっていないのだから、それほどに効率が落ちるということはないだろう･･･と今まで思っていたのですが今回の結果がこれだったので、考えを改めなければならないと思い質問をさせていただいた次第です。 過去の投稿を参考にさせてもらって、一応ホットスタートは試してみました。TakaraのPrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Bufferを使ってみたのですが（普段はEx Taqを使っています）、他の方法と同様に惨敗でした。一緒に試してみたgcクランプなしプライマーの方は恐ろしいほど増えたのですが。

(無題) 削除/引用 No.4349-2 - 2007/06/05 (火) 17:06:26 - トロジェンン みなさんがおっしゃるほど効率が落ちるかどうかは微妙ですが、 経験上、増幅効率は確実に落ちます。 理由はGCクランプが何かを考えればわかるかと思います。 （過去の投稿にPCRで増えにくい云々というのがたくさんありますので参考にしてみて下さい） もう既にやられているかもしれませんが、一度ホットスタートを試してみてはいかがでしょうか？私はHot StartTaqを使用することで増幅効率が劇的に改善された記憶があります。 あとは酵素自体を少し良いものに変えるというのも手かと思います。あまにも安価酵素ではGCクランプ付きのPCRは少し難しいかもしれません。私はTAKARAのExtaqかPromegaのGo taqを良く好んで使用します。これらはホットスタート無しでも良い増幅が得られることが多いです。 ただ、某社の最安TaqだとHot startをしないとうまく増幅しませんでした。 以上、参考になれば幸いです

gcクランプ付きプライマーのPCR増幅効率 削除/引用 No.4349-1 - 2007/06/05 (火) 15:24:19 - みな DGGEに供する目的で、土壌から抽出したDNAの断片（500bp程度）を増やしています。gcクランプなしのプライマーを用いて問題なく目的の塩基配列が増幅したので、フォワードプライマーにgcクランプを付けたものを用いて増やそうとしたところ、増幅効率が激減しました。ほとんど増えないといってもいいくらいです。アニーリング温度、プライマーやテンプレートDNAの濃度を変える、PCRサイクル数を増やす、増幅効率がよいといわれるポリメラーゼやバッファーを使う等、検討をしたのですが全く効果がありませんでした。 一般的にgcクランプ付きプライマーはgcクランプなしのプライマーに比べてPCRの増幅効率が落ちるのでしょうか。またその理由はなんなのでしょうか。ご存じの方がいらっしゃったら教えてください。

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