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(無題) 削除/引用 No.4352-3 - 2007/06/06 (水) 10:44:00 - 純ココア refolding時のタンパク濃度は重要だと思います。 モノによりけりですが、1mg/mLだとアグるかもしれません。 ご存知かと思いますが、抗凝集剤としてArgは非常に有効です。 0.5-1Mくらいの濃度で入れると凝集が見られなくなることがあります。

タンパク濃度 削除/引用 No.4352-2 - 2007/06/06 (水) 00:12:37 - 007 あかね様 今回、Urea濃度を下げて行く段階でアグリゲーションが起こってしまう可能性がありますね。僕はアグリゲーションが認められたら、その時点でサンプルを一部抜き取って、遠心後、上清のタンパク濃度を測定しています。 この作業により、少なくとも変性剤存在下でのセーフティーなタンパク濃度を知ることができます。次回の精製はこの濃度以下からスタートします。 さらに、遠心後のペレットは、SDS-PAGE(還元剤＋,-等)で解析しています。 アグリゲーションが解消される条件があれば、アグリゲーションのメカニズムが推察でき、bufferの改良につながります。 これらの情報は、次回の精製を飛躍的に向上させてくれるでしょう。 頑張って下さい。

refolding時のタンパク質濃度 削除/引用 No.4352-1 - 2007/06/05 (火) 16:41:01 - あかね 別のスレ(4339, 封入体の可溶化方法）の続きなのですが、 大腸菌で発現させたHis-tagタンパク質を変成条件化（6 M Urea)でメタルレジンを使って精製してきました。精製効率はかなり高く、ほぼ単一なバンドとして検出されます。 その後にrefolding操作をおこなおうと思っています。 Imidazolで要出した画分を, 2.5 M, 1.25 M, 0.6 M, 0.3 M, 0 M Ureaで透析しようかと思っています。 そこでrefoldingの際のタンパク質の濃度は重要ですか？ 今はおそらく1mg/ml程度になっています。 あまり濃いすぎると凝集してしまいますでしょうか？ サンプル溶液にはfinal 0.1 %のTritonXが入っています。

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