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(無題) 削除/引用 No.4373-5 - 2007/06/08 (金) 19:53:33 - KUMA そうなんですか。液量には気づきませんでした。 あと、円を描かないように気をつけて振ってみて、液量も適宜調節し、それでもだめならプレートを考えてみます！ 素早くかつ丁寧な解答をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4373-4 - 2007/06/08 (金) 19:31:46 - 名無し ひとつは振る方向かもしれない。円を描くように振るとそうなってしまうかも。振る回数は関係ないとおもう。あまり意識してやったことないけど、私は前後左右に４〜５回くらいずつ振ってからしまってます。いい感じで分布しております。 液量が少なすぎかも。液が少ないと壁面への表面張力みたいので周縁部のほうが液が多くて中央が少ないみたいな分布になるから、液量あたりの細胞が均一濃度なら細胞数は周縁部の方が多い事になるから、そのまま沈んで底にくっつけば環状になるよなあ、と今思いました。液量今の２〜３倍くらいに増やして様子をみたらどうでしょうか。 あとこれはかなりもしかというかすごいまれだけどプレートの底が平らでないのかもしれない。たまにだけど変なのある。代理店の人に訳を話せば上手くするとサンプルでいくつかの会社の製品を集めてくれる場合もあるから、それで試してみていい感じのものを選ぶのも手かも。 ウェルやディッシュの一方向の偏る感じならインキュベーターが水平に置かれていないからなので一度チェックしてみて下さい。

名無しさんありがとうございます 削除/引用 No.4373-3 - 2007/06/08 (金) 18:39:10 - KUMA 分かりやすい説明ありがとうございます！ 困っていたので、とても助かりました。名無しさんが示されている方法でやってみます。 あと、私は3T3-L1細胞を24wellプレートに蒔いて分化誘導をかけていますが、どうしてもwellの端に細胞が寄ってしまい、環状になるのでwellの中央に細胞がほとんどいないことが多いのです。蒔く前に細胞浮遊液をよく懸濁しwellに蒔いた後も前後左右にふっているのですが、ふりが足りないのでしょうか。 wellの中央に細胞が寄って増殖するという事はインターネットでよく目にするのですが、環状になるという話はあまり目にしません・・・ 名無しさんは細胞を培養している時はどのような感じですか？やはり、端に寄ったりしますか？ 長々と申し訳ないのですが、よろしければ教えて頂きたいです。

私ならば 削除/引用 No.4373-2 - 2007/06/08 (金) 10:11:37 - 名無し 3-cm 培養皿か24穴プレートで細胞増やしてPBSで軽く２回くらい洗って、そこにSDS=PAGEのサンプルバッツファ0.5ml〜1ml位入れて、それピペットで1.5mlチューブに移して、（DNA出てきてドロドロだからそのまま使うと電気泳動パタンがすごい汚くなってたぶんWBも失敗するので）、十分さらさらになるまでソニケーションして、そのごく一部とって１０倍くらいに水で希釈してからBCA試薬で蛋白質定量して、ミニゲルなら3〜8μgパーレインで電気泳動します。別にプロトコールとかそういうの見てとかじゃなくて何となくいつもそうやってます。すごいたまにだけど見たいのがすごい少なくてシグナル見えないときは、軽く分画してみます。（どういうやり方でもいいとおもうけど簡単なのは低張液で細胞破裂させて1000xgくらいで遠心機回して上と下分けたりとか、トライトンでとけるのととけないのとにわけてそれぞれ電気泳動するとかそういう感じ。）培養細胞使う場合、増殖状態（一杯いっぱいで分裂止まってる時かそれかまだ分裂してるときかとかそういうこと）の違いで結果が変わるときとかもあるから、抽出のプロトコールとかよりそういう方にむしろ意識を向けた方がいいかも。

3T3-L1細胞とウエスタンブロット 削除/引用 No.4373-1 - 2007/06/07 (木) 19:26:01 - KUMA 3T3-L1細胞からウエスタンブロットを行いたいのですが、論文やインターネットを検索しても、なかなかプロトコールらしきものにヒットせずこまっています。 周囲に経験者がいないので、ここでどなたかにご教授頂きたいです。 抽出にはよくTritonX-100が使用されているようですが、具体的なプロトコールが知りたいのです。 ウエスタンは動物組織から抽出したサンプルでは行ったことがあるのですが、やはり3T3-L1細胞だと特別な方法があるのでしょうか？ どこを検索すればヒットするかなど、なんでもいいので宜しくお願いします。

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