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(無題) 削除/引用 No.4396-31 - 2007/06/20 (水) 13:45:49 - K いろいろ検討を重ねた結果、スクロースを用いた 5 x を調製することにしました。 皆様、アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4396-30 - 2007/06/16 (土) 15:07:44 - 名無し ４回もアセトンで洗浄ってるなら酸が残ってどうもーーーみたいなことはまずないと思うしそれとサンプルバッハにビーピービー入れてたら酸性なら黄色くなるから分かると思う。一度冷たいエタノールで洗ってみたらどうでしょうかというのはアセトンってもともとアルデヒド基みたいのあるし前からちょっと気になってる。まれかもしれないけどいつまでも入れとくと架橋しないかなあと。S-Sが気になるなら戻らないようにアルキル化もしとけばいい。 フィルターを通して溶け残りを除いているという事は、沈殿が完全に溶けないということでしょうかTCAアセトン沈殿はあまり乾かしてしまうと非常に溶けにくいというかがんばってももう完全に溶けなくなることがあるのでまだチョッとぬれてますけどくらいで沈殿を黄色チップでつついていい感じに砕いてうすく広げてからすぐサンプルバッハいれるといい。つまんないことだけど全然違うこれが。沈殿が溶けにくいのとダイマー形成はあまり関係ないとおもうそれはその場合はバシッとしたバンドじゃなくてウエルからダーッというかんじのスメアーみたくなる。普通に溶けてる蛋白質でもSDS存在下でも非共有結合で多量体（分子量が整数倍のラダーみたいなの）になることはたまにあるけどこれはその蛋白質の性質に原因があるのだと思う。ポリペプチドのどっかが強固に会合してるのだと思う。

溶け残りはないと思うのですが 削除/引用 No.4396-29 - 2007/06/16 (土) 09:16:08 - T ＞名無しさん アドバイスをいただきありがとうございます。 確かに溶かしきれずにタンパク塊が出来ている可能性を否定できませんが、 泳動前にフィルターを通して(大きな)溶け残りは除いていますし、 ゲル上ではきれいな(スメアではない)バンドとして見られることから、 溶け残りの可能性は低いと思っています。 もともと対象としてるタンパク質は非還元条件下でS-S結合を介したダイマーを形成しやすいので、 酸性条件下での還元不足を心配しているしだいです。 ちなみにTCA沈殿後は 冷却アセトンで4回洗浄。 1xSDSサンプルバッファー(含100mMDTT)を加えて、室温で2時間攪拌。 超音波処理を5分間行った後、ボイル5分。 フィルターを通した後、泳動をしています。 下の質問とともに、もっと効果的なTCA沈殿の溶かし方をご存知でしたら、ご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.4396-28 - 2007/06/16 (土) 06:34:15 - 名無し TCA沈殿したら冷たいエタノールとかアセトンとかそういう乾くやつで沈殿洗ってそれからバッハに溶かせば酸性とかならないから洗った方がいいというか普通洗う。TCAやエタノールとかで沈殿しにくい蛋白質はあると思うのでそれがいやなのであんまりやらない。ダイマーできるのは還元不足というより沈殿をちゃんととかせていなくて蛋白質どうしがまだくっついているからだと思う。

併用できますか? 削除/引用 No.4396-27 - 2007/06/16 (土) 00:47:28 - T 還元剤に粉末から調製した100mM DTTを使って、ボイルもしています。 TCA沈殿などを処理するときに、時々還元不足のためか、 SDS-PAGEでダイマーが見られます。 page様がおっしゃるように ＞pHが8などのアルカリバッファー内だと「不安定」の様に見えますが、 実際には強力な還元力を発揮するのにはアルカリ化させる必要があります。 残存するTCAで多少酸性条件になっているとDTTは効果が薄いのかもしれません。 そこで質問ですが、 ｂMEなら酸性条件下でも還元力は落ちないのでしょうか? また、DTTとbMEを併用することは可能でしょうか? どなたかご存知の方がいたら、教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4396-26 - 2007/06/15 (金) 12:02:34 - K カナマイシン様 レスを見落としてしまいました >Sucroseは、50%で10x、つまりFinal5%で泳動バッファーとしてます。ちゃんと沈みます。 了解しました ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.4396-25 - 2007/06/15 (金) 11:39:51 - K glycerol は半分(final 5%)で沈みますか なら、6xでも30%だから、今の処方の4xよりもいいかも… どうもありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.4396-24 - 2007/06/15 (金) 11:25:56 - gene どうも、一口にSDSといってもメーカーやGRADEによってずいぶん品質が違うようです。ほかの試薬もそうなんでしょうが、とくにSDSでは顕著です。 析出のしやすさ（冬場でもめったに析出しないものもあれば、温暖な時期でも気がつくと析出しているものもある）、水に溶かしたときのpHなんかで実感します。 サンプルバッファーのグリセロールは確かに、半分くらいに減らしても実用上問題ないですね（サンプルアプライをよっぽど荒っぽくしたりしなければ）。 減らしたぶん水を入れるとSDSも溶けやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4396-23 - 2007/06/15 (金) 10:14:58 - 名無し すごい寒いとこの研究室だとすごい濃いサンプルバッファーとか10%SDSとかは３７Cのインキュベータで保存してる人もけっこういたのでまねした。あたりまえだけどSDSはいってるからカビとかばい菌増えないし特に問題ない感じ。（今は寒くないのでやってないけど冬になったらまたそうする。）もちろん還元剤は入れない状態。理由は朝来ると固まってるので溶かすの面倒だからということで。あとグリセロールはあれは単に沈ませるために入れてるだけだけ。沈みさえすれば何％でも別に適当でいいと思う。5%とかでも余裕で沈む。水素結合はすごい弱い結合だからなにもboilまでがんばらなくても50C〜６０Cくらいでたいてい壊れると思う。酵素とかが50Cくらいでインキュベーションすると失活するのは水素結合が壊れて高次構造が変わるからですよ、とがっこうでならったし前に。だから電気泳動のときのボイルはSDSの変性効果を促進するため,つまり早い話30分とか１時間とかかかる過程を、そんなに待つのが面倒なので数分でとっととすませたくてやってるのだと思う。bMEの還元も促進するとおもうけどこれはSDSの変性促進の２次的な影響だと思う、たぶん。

(無題) 削除/引用 No.4396-22 - 2007/06/14 (木) 16:33:34 - R うちで使ってる5xSample Bufferです。 Tris1.89g SDS5g glycerol10ml BPB25mg 最初に25mlくらいのDDWにTrisを粉末で入れてpHを調整し、続いてBPBとSDSを粉末で加え、最後にglycerolを入れて50mlにメスアップ。 常温保存で使用前に2-MEを加えて使ってます。 みなさんのものと比べてどうやらグリセロールが少ないですね(final 4%)。 でも今のところ問題ないです。 DTTについてですが、手元の実験書には SH基保護には1〜10mM、SS結合還元なら50〜100mM、より低濃度条件ではSH基はすぐに酸化される。 保護能力は嫌気的な条件下で保存しないかぎり、24時間以内に消失する。 ジスルフィド結合の形成は2価カチオンの存在下で促進されるので、キレート試薬と併用すると効果的。 とあります。

(無題) 削除/引用 No.4396-21 - 2007/06/14 (木) 15:44:40 - K sample buffer と一口に言っても組成がいろいろですね 研究室ごとに伝統的に使われている処方もあるようです。 とりあえず、4xSBを調製してみました。 が、難儀してます。 粉末のSDS とグリセロールとTrisをボルテックスで力一杯混和しても、 SDSが溶けませんでした。 ならば、温めてやれ、ということで、50℃くらいの温水浴に入れると、溶けてくれました。 しかし、室温に戻すと、分離してしまいます。 仕方ないので、温水浴に入れたまま分注しようかと考えています。 一応、組成を書いておきます。おかしい点があればご指摘ください。 4xSample Buffer 1 M Tris-HCl, pH 6.8 2 ml SDS 0.8 g glycerol 4 ml H2O to 7.6 ml -------------------------------------- mix aliquot of 380 μl store at -20 ℃ + 120 μl of 2-ME before use. (2-ME added aliquot: store at 4℃) mix sample : SB=3:1 それから一つ質問があります。 2-ME(原液)に相当する DTT の stock 濃度は 1 M ということでよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4396-20 - 2007/06/14 (木) 15:12:51 - gene レスをいろいろ読ませていただきましたが、SDS-PAGEには、DTTより安定性の高い2-MEを使うべきだ（使った方がいい）というのはかなり広く流布している考え、流儀、伝統あるいは伝承のようですね。 しかし、現在ではDTTを使う方法も非常に一般的であり、よく使われている実験書、プロトコール、市販のシステムでもそれがデフォルトになっているものも少なくないということを鑑みれば、それほど強い根拠はないように思います。 たしかに、2-MEはDTTより安定（ということは還元性が弱いということの裏返し）で、サンプルバッファーを非常に頻繁に使うような研究室では2-MEを入れて室温保存しているなんてところもあるようですが、そうはいっても程度の問題でしょう。2-MEだって保存中に酸化しますし（しなかったら還元剤になりませんから）、安定だからといって油断していると、やっぱりDTTで経験されたような不具合はおこるでしょう。むしろ、しっかり凍結保存されたDTTストック溶液（Molecular Cloningによると、10 mM NaOAc buffer pH 5.2で溶かして-20℃で凍結保存すれば安定である）を使った方が、安心・確実で作用も強いのでよいと私は思います。 サンプル調整でいったん還元したシステインが、再び酸化して（地上は酸化的雰囲気ですので）ジスルフィド結合をすることはあります。しかし、Aさんの例のようにいったん調製したサンプルを凍結融解を繰り返しながら何度も使うというような特殊な使い方ではなく、フレッシュなうちに泳動する限りは全く問題ないと思います。 新鮮なサンプルを泳動しても、泳動中にジスルフィド結合を生じてしまうことが問題になる場合もあるそうですが、そこまでいってしまえば2-MEだろうとDTTだろうと効果はありません。還元剤がタンパク質と一緒にゲルの中を旅するわけではありませんから。それを防ぐには、Aさんの指摘されたような方法でSH基をブロックしておくか、泳動バッファー添加する酸化防止剤（バイオラッドの市販品）を利用するほかありません。 サンプルをボイルするのは水素結合を切りSDSをかませるのを促進するのが主たる目的であるので（ボイルしない場合はSDSが水素結合を切りタンパク質に結合するまで長時間かける）、2-MEならボイルするけれどDTTではボイルしないというのはあたらないと思います。

いやあ、そうなんですが・・・ 削除/引用 No.4396-19 - 2007/06/14 (木) 14:39:47 - 酒多飲 サンプルバッファー中の還元剤が少なくなっていれば スタッキングゲル(pH6.8 ?)では S-S が戻ったりするのでは？ ゲルが中性付近の bis-Tris gel SDS-PAGE だと、 泳動バッファーに NaHSO3 を入れたりしますよね。

(無題) 削除/引用 No.4396-18 - 2007/06/14 (木) 14:09:39 - page DTTが熱で不安定だからボイルに意味がないということでは無いと思います。 DTTの反応性は熱量とpHに依存します。pHが8などのアルカリバッファー内だと 「不安定」の様に見えますが、実際には強力な還元力を発揮するのには アルカリ化させる必要があります。熱も同様です。熱で壊れるのでは無く、 アルカリ液内と同様に、熱すると、たとえDTT以外何もない液中であっても DTTはプロトンを放出し、液を酸性化させ、自らは酸化されます。もし、 ターゲットタンパク質が存在すれば、それらは還元されるということに なります。ですので、熱は反応性を高め、ハーフライフを短くするという ことです。酸性溶液中ではDTTは働きませんが極めて「安定」しています。 不安定と思う原因は、そのほかに空気による酸化もあるでしょう。 また、サンプルバッファー中にはSDSが入っていること、アルカリであること を考えますと、再酸化は極めて困難だと言えます。

(無題) 削除/引用 No.4396-17 - 2007/06/14 (木) 12:47:18 - A 濃度にもよるし、すべて完全に戻るという訳ではないと思いますが、少なくとも一部は徐々にランダムに戻ると思います。冷凍してしまっていたDTT処理の泳動サンプルを凍結融解くりかえして何回も使っていたら、だんだん分離パタンが悪くになってきた経験があるので。一方、同じような事してもβMEではまだそのようなことはありません。DTTは割と強いけど不安定でbMEはやや弱いけど長持ちすると言われるのはこういう事かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4396-16 - 2007/06/14 (木) 12:25:31 - カナマイシン >みなさま（特にA様） 便乗質問なのですが、DTTがボイルで熱失活するのはその通りだとして、 蛋白とDTTが出会った際のS-S結合切断は、 DTTが熱失活するとある程度もとに戻ってしまうのでしょうか？ それとも不可逆なものなのでしょうか？ 私はDTTで還元を、ボイルで熱変性を、ということで、 DTTを加えつつボイルもしています。 しかし可逆なのであれば、ボイルしてからDTT、の方が望ましいのかな、と 思われました。 ほんとに勉強になります。 当方はこのフォーラムの別スレを見るまで、 SDSサンプルバッファーにあらかじめDTTを混ぜた状態で凍結融解を繰り返してました。 きっとDTTの意味がなかったでしょうね・・・

(無題) 削除/引用 No.4396-15 - 2007/06/14 (木) 11:51:04 - カナマイシン >K様 遅くなって申し訳ありません。 Sucroseは、50%で10x、つまりFinal5%で泳動バッファーとしてます。ちゃんと沈みます。

(無題) 削除/引用 No.4396-14 - 2007/06/14 (木) 01:27:49 - D DTT、2Me、どちらを使っても 熱変性させるという理由でどちらもboilした方が良いと思いますよ 還元剤とSDSだけでキレイに分離して分子量どおりに並ばないものもありますから 抗原性が失われてしまう場合には色々変法を使うこともありますけどね

6x SDS sample buffer 削除/引用 No.4396-13 - 2007/06/13 (水) 18:09:40 - baq Hoefer 電気泳動装置 SE400 Sturdier (Amersham) の 取説に、6x SDS sample buffer が掲載されています。 ----- 6x SDS 処理バッファー (0.35 M Tris-Cl, pH6.8, 10% SDS, 30% glycerol, 9.3% DTT) 7 mL 0.5 M Tris-Cl, pH6.8 1.0 g SDS 3 mL glycerol 0.93 g DTT 1.2 mg BPB H2O to 10 mL サンプル溶液 5 容量に対し、6x SDS 処理バッファーを 1 容量 加えてよく混合し、95ﾟC、3〜4 分ボイルしたものをサンプルとする。 (1 mL ずつ分注し、-70ﾟC にて保存可能) ----- 細かく見るとあやしいのですが、細かいことは気にせず 使っています。

(無題) 削除/引用 No.4396-12 - 2007/06/13 (水) 13:11:38 - A 遅くなりました。DDTの件ですがたしか大学のときの生物学の実習用テキストの注意事項に書いてあったと思います。またSDS-PAGE では多くの場合DTTでなくてbMEをなぜ使うのですか？と質問したときに、蛋白質化学の先生からそのように教えてもらいました。それでそのようにしています。自分自身の経験ですが、bMEで処理した泳動サンプルは凍結融解繰り返しても泳動パタンは変わりませんが、DTTだとしだいに変化（チオール基の再酸化と思われる）してくるように見えた事があり、そういうことかなと感じました。 還元した蛋白質チオール基は反応性は高いので還元剤が劣化してくればまた酸化されてS-Sや他の混合ジスルフィドみたいなものを作る事もあると思います。これを防ぐため、時にはアイオードアセトアマイドなどのアルキル化剤でSH基を修飾してブロックする事もしばしばおこなわれています。 私は化学や生化学／分子生物学の専門ではなく、モレキュラークローニングという本は一度も使った事はありませんので、それについてどうこう言える立場ではありませんが、幸い私にもわかる基本的なことでしたので自分自信のつたない知識と経験をもとにして先の内容を記載しました。

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