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protein G coated ナノ磁気ビーズ 削除/引用 No.4437-14 - 2007/11/26 (月) 10:48:02 - こで 　ご参考になるか定かではありませんが、protein G coated ナノ磁気ビーズが市販されています。（http://magnabeat.com/product.html） 　無料サンプルもあります。 　ご参考まで。

ありがとうございました 削除/引用 No.4437-13 - 2007/07/03 (火) 16:14:00 - けい tip様 dynabeadsの件ありがとうございました。 購入してみようと思います。 また、何かありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4437-12 - 2007/07/02 (月) 15:29:39 - tip けい様 dynabeadsを用いたときは、プレクリアーは行いませんでした。また、プレブロックにsalmon spermは用いず、BSAのみで行いました。 これは、chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location, Nature Protocols 2006を参考文献として行いました。この文献で、dynabeadsが強く勧められていました。 Active MotifのChIP-IT Expressでも磁気ビーズを用いていますが、これはBSAによるプレブロックすら行っていません。ただし、場合によっては、BSA+salmon spermによるプレグロックも推奨しています。 sonicationが足りずに近傍の領域が落ちてくるという可能性に関しては、僕も考えはしたのですが、標的の転写因子は核内受容体であり、標的配列はゲノム上にはほとんど無いと思われますので、例えば50kb離れた所が落ちてくるということを想定しなければならなくなってしまい、その可能性は低いのではないかと思っております。

Dynabeadに関して教えていただけませんか？ 削除/引用 No.4437-11 - 2007/07/02 (月) 01:29:40 - けい > あれから、Dynabeadsを使用した所、non-immune IgGでIPしたサンプルのbackgroundが激減し、40サイクルまわしても全くシグナルが検出されなくなりました。 便乗質問申し訳ありません。 私も、ChIPのバックが高くて困っています。 Dynabeadを用いることでバックが減らせるとのことなので、 Dynabeadを購入してみようと思うのですが、何点か教えていただけませんでしょうか？ Dynabeadを使用した場合、プレクリアーもDynabeadで行いましたか？ また、Dynabeadにsalmon sperm DNAを混ぜて使用しましたか？ どうぞよろしくお願いいたします。 tipさんは、PCRをかけた5種類の領域全てでシグナルが出てしまうとのことですが、 素人考えで申し訳ないのですが、 ソニケーションが足りないために近傍の領域も落ちてきてしまうということは無いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4437-10 - 2007/06/29 (金) 19:01:57 - tip すみません。 もう一つ気が付いたのですが、現在、PCR productの長さは100bpに設定しております。実は短いDNA程非特異的に抗体にくっついてIPされやすいということはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4437-9 - 2007/06/29 (金) 17:34:57 - tip 皆様、先日はアドバイスありがとうございました。 あれから、Dynabeadsを使用した所、non-immune IgGでIPしたサンプルのbackgroundが激減し、40サイクルまわしても全くシグナルが検出されなくなりました。 しかし、喜んだのも束の間、今度は新しい問題が生じてきましたので、また相談に乗っていただけたらと思っております。 今回、non-immune IgGではシグナルは全く出なかったのですが、Ac-H3や現在目的としている転写因子Aに対する抗体でIPすると、PCRをかけた5種類の領域全てでシグナルが出てしまうのです。5種類のうち2種類は、周辺に遺伝子が存在しないジャンクと思われる領域ですが、それでもシグナルが出てしまいます。 具体的には、Ac-H3の抗体では、0.1% input程度、Aの抗体では、0.01%程度のシグナルが見られます。β-actin promoterのAc-H3は、1% input程度落ちてきています。 今回は、triplicateで行い、全て同じ結果になっておりますので、コンタミなどでもないと考えております。 non-immune IgGでは全く(0.001%以下)シグナルが出ませんので、抗体依存的なbackgroundだと思われますが、あまりにも強く、驚いております。 このような場合は、どのようにすべきでしょうか？ 現在、IPサンプル1つあたり、1×10^6個の細胞を用いていますが、もっと増やすべきでしょうか？ また、現在は、dynabeadsと抗体を始めにBSA存在下でincubateしていますが、ここにsalmon spermなどを加えたりするとよいものでしょうか？ よろしくお願いいたします

(無題) 削除/引用 No.4437-8 - 2007/06/22 (金) 17:11:21 - a 私はSP1で行いました。抗体はupstateのものを使用して、27サイクル程度でポジコンは見えました。PCRにはExTaqを使用しました。 ただ、サイクル数はソニケーションの条件は当然ですが、プライマーやPCR酵素の増幅効率に依存するところが大きいと思います。 とりあえずクリアな差が出るか確認することが重要だと思います。qPCRで2〜3倍程度の差を追うには危険な方法だなあと感じます。 ポジコンとネガコンでチェックするのが大切だと思います。 Active motifの良さそうですね。今度する機会があった変更してみます。

(無題) 削除/引用 No.4437-7 - 2007/06/22 (金) 11:10:00 - tip D様、アドバイスありがとうございます。 60サイクルでもbackgroundが出ないという事は、恐らく1分子の混入も無いのでしょうね。すばらしいと思います。 僕も、ChIPを始める時に、UpstateとActive Motifを見比べたのですが、論文で使われているのはUpstateが圧倒的に多く、Active Motifは、Bufferの組成が書いていなかった事から、Upstateを選択してしまいました。 改めてChIP-IT Expressのキットを見てみますと、確かに核抽出を行っていますね。また、ビーズのブロッキングやpreclearも不要となっており、nature protocolsの方法にかなり近いことが分りました。 ただ、ちょっとキットが高いので、とりあえず、Dynabeadsを買ってみて、Upstateのprotocolに当てはめてみようと思います。 他、何かコツのようなものがありましたら、是非教えていただければと思います。 よろしくお願いいたします。

ChIP 削除/引用 No.4437-6 - 2007/06/22 (金) 01:01:17 - D 自分もChIPでは苦労しました やはり最初はUpstate社のkitを使っていたのですが ここでどなたかがActive motifのプロトコルを進めていたので そちらのkitにしてみようと覗いてみると 恐らくMagnetコートしたdynabeadsと思われる磁気ビーズで しかもSonicationではなく酵素切断のkitがありました ChIP-IT Express Enzymaticというやつです そういえばこのkitでも核を分画していますね Upstate社のKitでもaさんと同じくWashをきちんとすることで バックをキレイに落とせるようにはなっていましたが イマイチ自信が持てずにデータはお蔵入りにしていました でもActive motifのkitは一発であっさりとキレイなデータがとれ 再現も簡単にとれたので助かりました 酵素は強力なので切断しすぎるとInputでもPCRが全くかからなくなります ここだけが注意点ですが 慣れれば歌い文句どおり再現を取るのは酵素の方が良いようです ちなみに自分は酵素処理後のChromatinタンパクをBCAで濃度を測定し タンパク量を揃えて行っています 普段は35 cycleでやっていますが、mouse、rabbit IgGではともに60 cycleまわしてもPCRはかからなくなりました

(無題) 削除/引用 No.4437-5 - 2007/06/21 (木) 21:34:31 - tip a様、貴重なアドバイスありがとうございます。 40サイクルでもbackgroundが出ないというのは素晴らしいですね！！ 洗いは全部で9回ほど行って、かなりしつこくやっているつもりですが、大体35サイクルくらいでbackgroundが出てきてしまいます。 そう考えると、磁気ビーズは非常に期待が持てる気がしてきました。 あと、僕もエッペンへの吸着は心配で、最後のwashだけは、別の新しいエッペンに移して行っています。 ところで、さらに便乗質問になってしまいますが、backgroundとは別に、どうもシグナルが弱い気がしています。 例えば、Acetylated Histone H3のβ-actin promoterへの結合は、32サイクルでやっと見えてくるくらいです。これは大体0.5% inputに相当するのですが、思ったよりもずっと弱いなーと思っています。 a様は、普通の転写因子のChIPなどを行われているのでしょうか？もしそうであれば、大体何サイクルくらいで見えることが多いか教えていただけないでしょうか？ また、ChIPの条件検討は検討項目があまりにも多すぎて大変だと思うのですが、特に有効な優先すべき検討項目がありましたら、教えていただけたらと思います。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4437-4 - 2007/06/21 (木) 19:50:57 - a 界面活性剤はどれが良いかはわかりませんが、ChIPのbackgroundは常に問題ですよね。 blocking無しだとかなりバックがでるように思いますが。この条件でも差が出るものもあるんでしょう。 私もupstateのkitを使用していましたが、backgroundに悩まされました。 　まず、エッペンチューブをBSAでblockingしました。シリコンコートで十分かも知れませんが。 　あと、アガロースビーズはwashしにくいのが難点ですね。ギリギリまで液を吸いとろうとすると、ビーズまで吸い込んでしまいます。それで、イエローチップの先1cm位のところをライターで溶かして→引き伸ばし→ハサミで先を切断してチップの先を細く改良しました。このチップをアガロースビーズの中に突っ込んで、洗浄液全てを吸い取るようにしました。 これで、30サイクルで出てきたbackgroundが40サイクルまで出てこなくなりました。結局、洗いむらで差が出てたという結論でした。 磁気ビーズだと壁面にビーズを固定できますので、残液を減らせるように思います。 ChIPアッセイは条件検討が必要ですので、がんばってください。あと、論文通りにやっても上手くいかないものもたくさんありますので気をつけてくださいね。

(無題) 削除/引用 No.4437-3 - 2007/06/20 (水) 22:59:06 - tip サイコ様、ご返事ありがとうございます。 やはり、エネルギーが逃げる可能性はありそうですね。とりあえず、次は固定してsonicationしてみようと思います。 ところで、題とは離れるのですが、最近、Nature Protocolsという雑誌があるのを知り、ChIP Assayの詳しいprotocolやコツが載っている論文がを3報ほど見つけました。 ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17406439&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17406230&ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17406303&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum です。3報とも熟読したのですが、現在行っているUpstate社のkitのprotocolと異なるところが多く、困惑しております。どなたか、アドバイスを頂けたらと思っております。 まず、upstateのprotocolでは、crosslinkをかけた後、すぐに1% SDSで溶解させてsonicationを行うのですが、上の3報は全て、crosslink後にnuclear pelletを分画し、その後にsonicationを行っています。やはり、核を分画するのはChIPでは望ましいのでしょうか？ 次に、upstateのprotocolでは、salmon spermでpreblockしたprotein G agaroseを用いるのですが、上の3報は全て、beadsをpreblockしていません。また、IPの際にもsalmon spermなどのblocking DNAを入れていません。個人的には、現在、backgroundが高い事に苦労していますので、salmon spermを入れなくてもChIPがうまくいくというのは驚きなのですが、こんなものなのでしょうか？ また、IPの経験がほとんど無く、sonicationやIPのbuffer条件も分らないところがあります。upstateのprotocolでは、sonicationは1% SDSで行い、IPの時は、これを10倍希釈して0.1% SDSで行っています。sonicationを1% SDSで行うのは、chromatinを可溶化させるためだと思っています。しかし、上の論文のうち3報とも、0.5% NP-40+1% Tritonや、0.5% NP-40+0.25% Tritonなど、かなりmildな条件でsonicationをしています。また、ある1報は、IPのbufferが、0.1% Na-Deoxycholate+0.5% N-lauroylsarcosineという条件なのですが、これは強すぎるということはないのでしょうか？ 最後に興味深かったのが、ある1報で、protein G coated Dynabeadsという磁気ビーズを用いると、backgroundが非常に低くなるという記述がありました。これが本当なら、試してみたいと思っているのですが、使用経験のある方はおられますでしょうか？ 長くなりましたが、どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4437-2 - 2007/06/19 (火) 23:46:22 - サイコ それは十分にありえる事だと思います。固定した場合は、エネルギーは逃げにくいですからね。かといって私は指でつまんでやりますが、、、。　でもそういう論文等に載っていない細かな事が重要だと思いますので、しっかりとした再現性（つまんだ場合と固定した場合）をとって決めた「実験に適した」やり方で実験を進めるのがいいとおもいますよ。そういう観察力は非常に大事です。

sonicationにおけるエッペンの固定 削除/引用 No.4437-1 - 2007/06/19 (火) 22:31:24 - tip いつもお世話になっております。 ChIP Assayを行い、sonicationで苦労しております。 1.5mlエッペンに、細胞懸濁液を600ul入れ、Branson Sonifierで5sec×40setでsonicationを行い、chromatinのshearingをcheckしています。 1回目は、100bp〜500bpと、切れ過ぎたくらいだったのですが、2回目、3回目は、200bp〜5000bp位の切れ方になってしまい、再現性が取れていない状況です。 ただ、一つ気づいたのですが、エッペンを指でつかんでsonicationをかけた時と、コニカルチューブやエッペン立てに固定してsonicationをかけた時で、音が全く違うのです。指でつかんだ時は、静かな細かい音なのですが、固定した時は、大きく、きーきーした音がします。 思い返してみると、1回目はエッペンを固定したのですが、2、3回目は指でつかんでsonicationをかけました。 ここで思ったのですが、指でつかんでsonicationをかけると、超音波の振動が柔らかい指で吸収されるなどで、うまく超音波が効かないのでしょうか？ 周りに聞く人もいないのですが、sonicationの時に指でつかまないというのは常識だったりするのでしょうか？それとも、心配しすぎでしょうか？ つまらない質問ですが、よろしくお願いいたします

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