全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4480-10 - 2007/06/29 (金) 17:54:04 - 困った・・ T様 参考になる情報ありがとうございます。 とりあえず、酪酸の濃度をふって試してみることにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4480-9 - 2007/06/29 (金) 15:09:57 - Ｔ このスレが参考になります。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3725

(無題) 削除/引用 No.4480-8 - 2007/06/29 (金) 14:57:03 - 困った・・ T様 ありがとうございます。ちなみに酪酸ナトリウムはどれくらいの濃度で使用すると良いのでしょうか？ 教えて頂けると助かります。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4480-7 - 2007/06/29 (金) 10:50:45 - Ｔ 酪酸ナトリウム (Sodium Butyrate) を加えると回復する事があります。

(無題) 削除/引用 No.4480-6 - 2007/06/29 (金) 10:15:20 - 困った・・ 皆様 たくさんのご意見、ご助言ありがとうございます。 やはり起きうる事象だったのですね。 Dさんも書かれていますが、ベクターの性質を考えた場合、薬剤耐性が残りながら目的遺伝子が落ちると言うことは考えづらいかと思ったのですが、サイレンシングですか・・・。 確かに癌抑制関係の遺伝子なので（ラット由来ですがヒトともホモロジーが高い）、その可能性は高いかなと勝手に思っています。 とりあえず、本当にサンレンシングかどうかゲノムＤＮＡで調べてみることにします。 もし、ゲノムDNAに入っていたとして一過性にでも発現を復活させる方法って無いものなのでしょうか？（もう一度トランスフェクションという選択はのぞいて）。とりあえず実験時にだけでも発現があがってくれると助かるんですが・・・ やはりTet-onなどを使用するのが良いのでしょうか・・・ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4480-5 - 2007/06/29 (金) 07:48:44 - 通りすがり おきますね、ESを扱ってると散々そういう経験はしてますし、 普通のHeLaとかでもおきますよ。 ただ脱落してるのではなくほとんどの場合 Silencingされて転写量が激減しているのが原因です。 サザンとかやってもゲノムに組み込まれてるのは確認できますし。 IRESを入れていて理論的に薬剤耐性なcloneは全て目的の遺伝子を発現しているはずですが、neoの耐性に十分な量のmRNAが発現しているのにも関わらず 目的の遺伝子がwesternなどでは検出できないレベルであることはしばしばおきます。 細胞がneo耐性を獲得するために必要な発現量というのは 世間で思われてるよりもはるかに低いです。 逆にpuroやzeo耐性遺伝子などはかなり多くの発現量がないと耐性にならないのでires-puroなどを使うと、ほとんどのcloneでiresの前においてるタンパクの発現量は十分確認できるレベルのはずです。 ただがん抑制さんのいってるように、細胞に何らかの障害をあたえるようなものだと発現量が多いstableは永久にとれないときなど多いのでiresーneoなどのほうが適切な場合というのもきちんと存在します。 自分の場合は戦略として ires-neo, ires-hygro,ires-puroの３種類全てを用意して 全部で目的の遺伝子をいれてやってみて、 一番適当なvectorがどれかを考えるという方法でやってます。 次にどれでもダメならtet systemみたいにconditonalなほうに行くというパターンが多いですね。だいたいこれで成功しますが。

(無題) 削除/引用 No.4480-4 - 2007/06/29 (金) 06:15:18 - がん抑制 アポトーシス誘導遺伝子とか、がん抑制遺伝子とかで（ビトロの生存に不利な遺伝子）でよく起きることですね。

(無題) 削除/引用 No.4480-3 - 2007/06/29 (金) 03:11:33 - YT >薬剤耐性遺伝子だけを残して脱落 It often happens. Try searching past topics with a keyword "安定株".

IVS 削除/引用 No.4480-2 - 2007/06/29 (金) 01:27:01 - D 自分もIRESをよく使いますがそのような事は一度もないし IRESのメカニズムを考えればmRNAが転写されていないとおかしい もしG418のSelectionが正しく行われて、目的の配列全長がgenomeに組み込まれているとすれば、少なくとも転写はされているんでしょうね 自分はintronを含むvectorでStableを作ったことはありませんが pIRES-neo3は CMV-MCS-IVS-IRES-neo となっているようで、MCSとIRESの間にintronがあるから Stableにしたときはよろしくない事が起こってしまったりするのかな？ 初心者のようだし書かれた情報だけではいくらでもどこかでミスってる可能性がありそうで判断できないです G418って弱くて時間がかかるから意外と初心者には難しいのかも そういえばATCC由来のHeLaやHEK293のgenomeを制限酵素で切断してSelf-ligationしてKm培地にトランスフォーメーションすると、一定の割合で大腸菌が生えてきてびっくりしたことがありますよ

Stableに組み込んだ遺伝子が消失？ 削除/引用 No.4480-1 - 2007/06/28 (木) 18:32:19 - 困った・・ いつも参考にさせて頂いています。 pIRES-neo3というベクターにあるラットの遺伝子を導入して、ヒトの接着系細胞に組み込みました（ラットの細胞で試したのですが、トランスフェクション時にほとんど死んでしまうので）。 G418でセレクションを行い、耐性のある細胞群（クローニング前の複合集団）からRNA抽出を行い、リアルタイムPCRで発現を確認したところ、きちんと目的の遺伝子の発現が見られました。 細胞数を増やすため、またクローニングを行うために4-5回継代しクローニングを行いました。 しかし、得られたクローンはもとより、4-5回継代した後のクローニング前の複合集団ですら目的の遺伝子が検出できないという状況になってしまいました。 一方で、G418に対する耐性は未だに維持されています。 教えて頂きたいのですが、Stableに組み込んだ遺伝子が継代を続けることによって薬剤耐性遺伝子だけを残して脱落するようなことがあるのでしょうか？ あるとしたらやはりヒトの細胞にラットの遺伝子を組み込んだことが問題でしょうか？ 細胞をさわりはじめてまだ間もなく困っております。 ご助言、ご意見よろしくお願いします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---