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自己解決しました 削除/引用 No.4494-20 - 2007/07/06 (金) 21:43:15 - 周 質問をしていて何ですが，自己解決しました． 日曜からタイムコースを取りますので，解決できない問題ができたら 再び質問させていただきます． 13friday様，T様，T-2様，TS様，通りすがり様，貴重なご意見を 頂いたことに大変感謝しています．ありがとうございました． 初めての投稿でしたが，すごく勉強になりました．

! 削除/引用 No.4494-19 - 2007/07/06 (金) 18:56:20 - 周 TS様 早速の返信ありがとうございます．いつもお世話になります． >培地を抜いて２−３回ice-cold PBS(-)で洗って直接sepaselをかけてスクレーパーで剥がす（すでにLycateですが）ので十分取れると思います sepasolをかけて剥がした細胞をそのまま直接-80℃で数週間保存することは可能でしょうか？もちろんRNaseを加えたりする必要はあると思いますが． というか，細胞を剥がしたまま抽出作業へ入ることなく-87℃保存することは 可能なのでしょうか？以後の目的はRT-PCRによる発現量解析のみなのですが… タイムコースをとって抽出するので，3日毎に抽出作業をするのも可能ですが，毎回抽出作業をすると回収量にばらつきがでるのではと懸念しています（もちろん手間がかかって…という理由もあります）． はがした細胞を保存しておいて，タイムコース終了後に解凍・抽出したいので，はがした細胞の保存方法について教えていただきたいです． よろしくお願いします．

sepasol 削除/引用 No.4494-18 - 2007/07/06 (金) 18:18:13 - TS を使うのなら、培地を抜いて２−３回ice-cold PBS(-)で洗って直接sepaselをかけてスクレーパーで剥がす（すでにLycateですが）ので十分取れると思います。酵素処理（MC3T3-E1だとトリプシンじゃはがれなかったとおもいます）しなくともいいと思いますが。少なくとも培養２週間くらいまでこれで問題なく取れてました。

(無題) 削除/引用 No.4494-17 - 2007/07/06 (金) 18:01:48 - 周 通りすがり様 紹介いただいた論文についてですが，随分前に目を通したものの，内容に ついては失念していました．再読しようと思います． ご指摘ありがとうございます． RNA抽出の話に戻ります．タイムコースを取り終えてから一斉に RNA抽出→RT→PCRを行いたいのですが，タイムコースを取り終えるまで はがした細胞を保存しておく方法についてご意見を頂きたいです． スクレーパーで物理的にはがすのとトリプシンではがすのとでは どちらがRNA回収量は見込めるのか，lysis bufferを用いる方法はとれる のか，etc.. ご存知の方いらっしゃればご指南下さい． よろしくお願いします．

読んでいると思うが・・・ 削除/引用 No.4494-16 - 2007/07/05 (木) 09:25:47 - 通りすがり 気になったので一つだけ、 細胞株を樹立した人に直接連絡というのは非現実的かもしれないが、 自分が用いている細胞を樹立した論文くらいは読んではどうだろうか。 その論文で培養に用いられた培地なども参考にはなると思うが・・・ 実験のプロトコルに夢中になりすぎて、本質を忘れている研究者が多い気がする。 J Cell Biol 96:191(1983)

RNA抽出プロトコル 削除/引用 No.4494-15 - 2007/07/04 (水) 18:14:26 - 周 TS様 >ただ粉末培地を買って研究室で作っている場合は、水に注意してください。 書き損じてしまいましたが，500mlの液体培地を購入していますので，そちらのロットチェックは必要なさそうですね． RNA抽出プロトコルですが，ナカライのHPにあった↓ http://www.nacalai.co.jp/online/pdf/BULLETIN-L-101-2-070322.pdf で試してみようと思います．スタートの細胞量が1×10^5cellsとかなり 少ないことが心配ですが… このステップで抽出するにあたって特に留意すべき事項があれば 是非教えていただきたいです．

培地 削除/引用 No.4494-14 - 2007/07/04 (水) 09:49:26 - TS 培地は、同じα-MEMでwakoとinvitrogenなら血清ほど問題はないと思います。ただ粉末培地を買って研究室で作っている場合は、水に注意してください。

(無題) 削除/引用 No.4494-13 - 2007/07/04 (水) 00:05:15 - 周 TS様 >いくつかのメーカーからできるだけロットチェック用の血清をもらいチェッ>クした方がよいように思います。できたらsubcloneを確立した論文のの筆者>または同様の実験をやってうまく石灰化に差が出ている論文の筆者にあたっ>てその辺りの情報を入れた方がいいですよ。 丁寧なご解答ありがとうございます．非常に助かります． 自分は学部生ですので，論文の筆者にあたって情報を仕入れるというのは 非現実的です．ロットチェック用の血清を各メーカーからもらって それぞれ比較してみたいと思います． 培地もロットチェックはすべきでしょうか?　現在安価なWAKOのα-MEMで 試験的に培養・誘導をかけていますが，石灰化の度合い・時期がinvitrogenのものと若干異なるので，やや懸念しています…

かならずしも 削除/引用 No.4494-12 - 2007/07/03 (火) 17:31:18 - TS 観察したい現象を最も端的に表す培養条件にATCCが推奨しているメーカーのものがbestとは限りませんし、同一メーカーでもロットごとに差があるものです。いくつかのメーカーからできるだけロットチェック用の血清をもらいチェックした方がよいように思います。できたらsubcloneを確立した論文のの筆者または同様の実験をやってうまく石灰化に差が出ている論文の筆者にあたってその辺りの情報を入れた方がいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.4494-11 - 2007/07/03 (火) 15:36:42 - 周 TS様 石灰化しない細胞(subclone24)はATCCから購入したもので， 購入後ずっと同じロットの血清を使い続けています．2度ほど石灰化 前後でタイムコースをとってsubclone14と平行して染色をかけてみました が，ほぼ同じタイミングで染色が始まります（約10日後）． 染色具合が若干異なるので，現在はその点について調査していますが， 血清のロットチェックは行っていませんでした． 使用している血清はATCCが推奨しているinvitrogenのFBSを使用しています．

すこしずれますが 削除/引用 No.4494-10 - 2007/07/03 (火) 13:49:03 - TS 昔、MC-3T3E1を６年ほど使ってました。RT-PCRもしました。trisol/isosolなど使って普通にtotal RNAとれます。もちろんカラムを使ったキットでも問題なくとれました。（繊維芽細胞を使った事があればほぼ同じと考えてもらっていいと思います。高度に石灰化させた場合は別ですが。）ただ少し気になるのが、石灰化しないsubcloneでもアリザニンレッド陽性になっていることです。MC-3T3E1は、培地により性格が左右されやすい印象があります。少なくとも血清のロットチエックをして所定の細胞特性(石灰化の有無、分化マ−カーの状態、増殖曲線）が再現される物を使ってください。培地も参考とした文献があるならそのメーカーの物がいいと思います。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.4494-9 - 2007/07/03 (火) 10:59:06 - 周 T-2様 >CTAB法というのは詳しく知りませんが、 プロトコールを見る限り酵母や植物など 溶解しにくい場合用いるのでは？ おっしゃる通りです．本研究室では植物のカルスなどの抽出時に CTAB法を使用しているようです． いわゆるAPGC法で検討を重ねてみます．今日明日にでも プロトコルが決まり次第このトピックに書かせて頂きます． その際またご意見・ご指摘の程よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.4494-8 - 2007/07/03 (火) 09:52:49 - T-2 前出の方と名前が同じでしたね。 Sepasolも基本はAPGC法だと思います。 CTAB法というのは詳しく知りませんが、 プロトコールを見る限り酵母や植物など 溶解しにくい場合用いるのでは？ 私の場合はいわゆるAPGC法で問題なく抽出できました。

Sepasol-CTAB法 削除/引用 No.4494-7 - 2007/07/03 (火) 09:18:21 - 周 T様 >自分の場合はISOGEN(Trizol類似品)を使用しました。 現在検討中の方法の1つとしてSepasol試薬を用いたSepasol-CTAB法 を考えています．プロトコルとしてはISOGENのプロトコルの流れと 似ているのですが，Sepasolでの経験はありませんでしょうか？ APGC(Acid Guanidium-Phenol-Chroloform)法でも抽出できないか検討中ですので，こちらの方も経験ある方いらっしゃればご意見頂きたいです．

(無題) 削除/引用 No.4494-6 - 2007/07/02 (月) 22:40:28 - T 参考になるかわかりませんが・・・ MC3T3-E1からRNAを抽出し、RT-PCRをしたことがあります。 要するにマトリックスが多いので、 それをどう処理するかが問題だと思います。 自分の場合はISOGEN(Trizol類似品)を使用しました。 ポイントは抽出試薬を多めに使うことです。 そしてやはりマトリックスなどは溶けないので、 よくボルッテックスした後、遠心して上清を移し変えて、 以下はプロトコール通りに行いました。 これで問題なくPCRできました。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.4494-5 - 2007/07/02 (月) 21:57:52 - 周 T様 >そもそも培養細胞からの RNA 抽出法一般について知りたいのか、何か MC3T3-E1 細胞固有の事情について知りたいのかどちらでしょうか？ 後者です．紛らわしい言い回しで申し訳ありませんでした． 現在，subclone14（石灰化する集団）と24（石灰化しにくい集団）の2種類を培養している状況で，石灰化誘導をかける前後でタイムコースを取り， いつの時点でマーカータンパクが発現しているかをRNAレベルで 確認することが目的です．目的はあくまで発現量解析のみと考えています． ちなみに石灰化自体はアリザリンレッドによる染色により既に確認済み ですが，なぜか石灰化しにくい24でも染色が確認されます． なお，RNA抽出は今回初めての試みとなります．ラボの環境から Real Time PCRを極力使わない方向でいきたいのですが，調べた限りでは Real Time PCRで発現量解析をしている文献が大半です． 故に，本細胞でRT-PCR実験を行った経験のある方のご意見を頂きたいです．

(無題) 削除/引用 No.4494-4 - 2007/07/02 (月) 19:33:23 - Ｔ そもそも培養細胞からの RNA 抽出法一般について知りたいのか、何か MC3T3-E1 細胞固有の事情について知りたいのかどちらでしょうか？ 前者なら多数出版されている教科書やマニュアル本で勉強してください。 キットを使わなくても抽出可能ですし、24ウェルや6ウェルから十分な量が取れるかどうかは目的によります。 Real Time PCR で定量するなら普通は十分でしょう。 RNA 抽出法については十分知っているけれども、MC3T3-E1 細胞の場合には特殊な事情があるというなら、その事情について書き込まれた方が情報が得られると思いますよ。 ちなみに私は MC3T3-E1 細胞については何の知識もありませんが、軽く検索しただけで多数の文献が見つかりました。それを見る限りでは、通常の RNA 抽出と何ら変わることはなさそうですが。

ご指摘の通りです 削除/引用 No.4494-3 - 2007/07/02 (月) 19:06:59 - 周 返信ありがとうございます． 探し方が不十分な点は痛感しています．キットを用いないで 抽出する方法の有無，抽出に必要なRNA量は24wel plateや6wel plateのようなサイズで事足りるのか，といった情報を求めているのですが，なかなか ヒットせず苦慮しています． 不勉強で申し訳ないですが，アドバイス頂けたら幸いです． 宜しくお願いします．

すぐ見つかりましたけど・・・ 削除/引用 No.4494-2 - 2007/07/02 (月) 16:54:04 - 13friday 論文とかどのように探しているかは、分かりませんが、探し方が不十分じゃないですか？ たくさん載せてもきりが無いので、ある論文の1部を載せます ↓ MC3T3-E1 cells were plated with non-supplemented a-MEM and with medium supplemented with 25mM CaCl2 on plastic CP, on gypsum disc, as well as on PMMA to determine the effect of Ca2+ concentration of 25.5mM and the effect of gypsum surface on gene expression profile. Total RNA was isolated from cell cultures of 15 days using High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany).

MC3T3-E1細胞におけるRNA抽出法 削除/引用 No.4494-1 - 2007/07/01 (日) 22:51:58 - 周 骨芽細胞の分化マーカータンパク(BSPやOCNなど)の発現量を 分化誘導前後でタイムコースをとって調べたいのですが， RNA抽出方法について詳細に記した文献がなかなか見つかりません． 該当する文献，もしくは抽出方法について情報・知識をお持ちの方， いらっしゃいましたら是非ご教授下さい． よろしくお願いします．

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