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いいわすれてた。 削除/引用 No.4521-19 - 2007/12/25 (火) 22:17:35 - T氏 反応系を小さくするのは是非おすすめ。 しかし、反応系を小さくすればするほど菌の持ち込み割合も増えるのでTaq系の有用性は増します。 私は２０マイクロリットル前後でやることが多いです。Taq系なら酵素希釈も結構うまくいきますが、多少ミスも増えます。やるなら系を小さくするのがベスト。

概論 削除/引用 No.4521-18 - 2007/12/25 (火) 21:52:22 - T氏 　コロニーPCRの最適酵素の選択法として第一に酵素の核酸許容性の高い酵素がお勧めだと思います。コロニーをちょこっとつついたり、コロニーを一度水とかに懸濁して希釈したりするとある程度反応性の高い酵素だったらどんなものでもOKだとおもいますが、適当にコロニーをつつくとたくさんの菌が入って失敗が多くなると思います。この失敗原因は菌のゲノムがたくさん反応液に入ってしまうため、酵素がいろんなところに張り付いて有効酵素が少なくなるためだと予想されます。よってプライミング効率の高いアルファー型の酵素（PfuとかKODとかです。大概フィデリティー高いやつは全部そう）はコロニーPCRの選択には論外です。反対にTaq、TthなどのPolI型？の酵素はいくら核酸が入っていてもびくともしませんのでお勧めです。よって適当にコロニーPCRしがちな人はとくにPolI型の酵素を使うべきかと思います。無駄にアルファ型酵素は高価ですしね。。。 　また反応性ですがExTaqとかLATaqとかがベストでしょうけどユニバーサルなプライマーを利用する分には大概Taqで事足りる気がします。私はあまり使ったことはありませんがPromegaの安いTaq（本当に一番安いかは不明＠＠；）で十分ではないかと。。。ちなみに私はスピードと安定性も重視してるので（実験量がすごく多いですし、下のものにやってもらうことが多いため失敗されるとわけわかんなくなるので。）タカラのSpeedStar？（タカラの人に薦められた、酵素はExTaqらしい？？）使ってます。 まとめ Taq系の酵素がおすすめ 安価重視ならプロメガ？ 安定性重視ならタカラ？

(無題) 削除/引用 No.4521-17 - 2007/07/20 (金) 07:52:22 - おお ちなみに私の場合コロニーPCRは基本的にしません。シーケンス、網羅的解析が目的なら話が変わってきます。もし配列を読めば良いのならコロニーPCRのフラグメントをそのままシーケンスでもいいような気がします。もし必要なら安いタックで基本的にいいのではないかという気もしますし、ホームメードを使うというのも海外ではよく聞きます。インサートによって条件の検討が必要とか、特別なタックを用意しないといけないと言うことになるとあまりコロニーPCRのメリットがないとも思えますし、そういうことが何かいかに一回でも起こる可能性があるなら、コロニーPCRをやるメリットはないと思います。実際にそういうことが起こりそうなので基本的にコロニーPCRはしないか、第１選択ではないと言うのが私の個人的なとらえ方です。

(無題) 削除/引用 No.4521-16 - 2007/07/12 (木) 14:07:55 - K >Jack 様 朝イチでコロニーを滅菌爪楊枝で拾って、反応液に懸濁、新しい LB/antibiotics plate に植えてます。 インサート確認した上で、夕方頃、レプリカから液体培地に植えて次の日プラスミド抽出、シーケンス反応、翌日エタ沈、シーケンシング としてます。

(無題) 削除/引用 No.4521-15 - 2007/07/12 (木) 13:17:38 - Jack 30-35cycleなのですね。どうもありがとうございました。 ちなみに、コロニーを拾ってPCRチューブに移した後、レプリカはどうしてますか？ １．拾ったコロニーに番号をふる。 ２．レプリカプレートを作る。 ３．そのまま液体培養にかける。 便乗質問、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4521-14 - 2007/07/12 (木) 13:14:50 - K promega のものを使われているケースが多いみたいですね。 大変参考になりました。 ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.4521-13 - 2007/07/11 (水) 17:47:15 - mimi Gold Taq(ABI)で35cycle。反応液の調整が非常に楽だから。 酵素量は規定の1/20で十分です。

(無題) 削除/引用 No.4521-12 - 2007/07/10 (火) 12:48:41 - DNAI 私はpromega の一番安い taq で10μＬスケール、30 cycle で elongation 1〜3 min （インサートによる）で実施しています。ただし、TA cloning の場合は、８割以上でインサートが入っていますよ。ちなみに、ＫＯＤ plus ＋TArget cloneの組み合わせです。

(無題) 削除/引用 No.4521-11 - 2007/07/10 (火) 12:48:14 - PPP セールの時に買い込んでしまった古いExTaqを使っています。クローンの好き嫌いなくバンバン増えるという印象です。

(無題) 削除/引用 No.4521-10 - 2007/07/10 (火) 12:37:03 - K >Jack 様 PCR は 30 cycle で elongation は 3 min だったかと思います

(無題) 削除/引用 No.4521-9 - 2007/07/10 (火) 12:03:36 - Jack PCRは何回まわしていますか？

(無題) 削除/引用 No.4521-8 - 2007/07/10 (火) 11:23:15 - K >APE様 ベクターの名前とインサートのサイズを教えてもらえないでしょうか？ paq5000 はこちらでも使用してみたのですが、pGME-T にサブクローニングしたインサート 1 kbp は増やしてくれたのですが、 2 kbp はだめでした。

(無題) 削除/引用 No.4521-7 - 2007/07/10 (火) 09:26:28 - ３ promega　taq使ってます。 反応液は全量10ulで。 こんな感じで使ってて、コロＰにすごいお金かかっちゃうなーって印象は 今のとこないです。 まぁ、たいした数のコロニー拾わなくてもいい実験だからかもだけど。 ご参考までに。 ただインサート長めだと（2Kb以上とか）あんまりよくないイメージはありますね。 （コロＰで出なくて一応制限酵素でチェックすると入ってるとか） 配列によるのかもだけど。

(無題) 削除/引用 No.4521-6 - 2007/07/10 (火) 09:20:23 - APE 個人的にはα型のポリメラーゼでは出方が不安定な印象があります。 コロニーを滅菌水等に懸濁しないので有れば特に傾向が強いと思います。 最近は、paq5000（stratagene）というコストパフォーマンスの良い酵素を使用しています。コロニー直接ほりこんでも普通に増幅します。

(無題) 削除/引用 No.4521-5 - 2007/07/09 (月) 18:49:07 - 〜 Pyrobest LA-taq Sigma taq Promega taq Phusion Pfu を使ったことがありますが、 インサート次第で増えたり、増えなかったりします。 LA-taq Phusion taq　（買う時に安いところ） 辺りをルーチンに使っていました。 私は、反応液のVolumeを減らすと、 増えやすさに影響があるように感じられたので、 polymeraseだけを減らして使っていました。 (Volumeは10~20uL) メーカー推奨の1/5位までは減らせるようでした。

(無題) 削除/引用 No.4521-4 - 2007/07/09 (月) 15:47:34 - bima 個人的には安い酵素を探すより反応液量を減らした方がいいと思います。 泳動に用いるのは5マイクロlもあれば十分なので、サーマルサイクラーの性能を考慮してできる限り低容量でできるラインを確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.4521-3 - 2007/07/09 (月) 15:28:09 - T-2 東洋紡のKOD Dashに一票。 理由は伸長反応がはやいから。

(無題) 削除/引用 No.4521-2 - 2007/07/09 (月) 14:09:27 - う〜んと プロメガの製品が安くて熱に強くて好きでした。 PCRエラーが多くて、2〜3kbくらいしか伸びませんが、コロPには十分。 難しいクローニングで、（一日に百を超えるとか）あまりに使用量が多いのなら、大腸菌サスペンジョンをプールして鋳型にするとかしてみてはどうでしょう。（やったことないけど）

colony direct PCR 削除/引用 No.4521-1 - 2007/07/09 (月) 13:50:17 - K いつもお世話になっております。 今回伺いたいのは、E.coli の colony direct PCR(コロPで通じる？)です。 それも実験の手法ではなく、使っているDNA polymeraseです。 ご存知の通り、青白スクリーニングは万能ではなく、時折、 白コロニーなのに空ベクターだったり、青コロニーなのにインサート入りだったり(この場合は、青が若干弱いような感じをうけます)しますので、 コロPでポジティブクローンを選択することは重要かと考えます。 コロPでは拾うコロニー数によっては、ポリメラーゼの消費量も馬鹿にはならなくなりランニングコストが高くついてしまいます。 そこで質問、というか、アンケートです。 皆様はどこのポリメラーゼを使用しているのでしょうか。よろしければ、使用感などをお聞かせください。 ちなみに、当方では Sigma 社の Taq polymerase を使用しています。

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