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(無題) 削除/引用 No.4546-13 - 2007/07/20 (金) 20:30:41 - aa 300xgとか700xgとか議論するときに、チューブのどの位置の遠心力を考えているのかが問題ではないのでしょうか？15ccチューブのように長いチューブにたくさん入れると、トップとボトムで当然、かかる遠心力が異なってきます。以外に重要なのではないでしょうか？ 最近の遠心機は、xg単位で設定できるようになっていますが、当然それは特定の遠心半径での遠心力ですから、300xgがかかっていると思っても、それは遠心中の細胞懸濁液全体が300xgではないということです。この点だけを考えると、おそらく10mlの細胞懸濁液を15ccチューブと50ccチューブで同じ条件で遠心すると、50ccチューブの方が良く回収されると想像できます。

遠心条件＆MACS 削除/引用 No.4546-12 - 2007/07/20 (金) 10:58:12 - アシタカ えんしんさん >600（〜700）xｇ　で 2(〜4)min searaさん >遠心は、約700g　5min うちで使っている遠心機で2000回転くらい、かなり強い条件ですね。 私の手元にあるMACSのプロトコールは300xg 10min ですけれど、 searaさんもMACSのプロトコールからですか？ マウスのリンパ球は、ヒトより小さいからでしょうか？ それでももう少し遠心条件をきつくしようかな〜？ 確かにチューブは小さい方がいいと思いますが、 私が使ったビーズは、B細胞分離用（ネガティブセレクション）でして、 先日は、4 x 10exp7 細胞でしたから、抗体そしてビーズを 加えた後が400ul、さらにビーズを除くためにバッファーを8ml 加えましたので、15mlのチューブを使っています。 再度実験してみますので、今度は上清は捨てずに、 チェックしようと思います。

すこしちがうかもしれないけど 削除/引用 No.4546-11 - 2007/07/19 (木) 15:44:36 - seara マウスのプライマリーのリンパ球（浮遊）を使ってMACSを日々やっているものですが、少しは減りますがここまで減った記憶は有りません。 遠心は約700g　5minでやっています。 少し気になったのがチューブの大きさなのですが107単位の細胞量でしたら5mlのチューブでやっています。 ミルテニーのビーズだと107セルで10ulのビーズ添加/計100ul反応だとおもいますの15mlですと大きいのでは。 細胞が壁面に付いていると仮定してチューブの大きさが大きい程プラの面積が大きく細胞を付着させやすいとおもいます。 少しずれますが大量の細胞を取りたくて、マウスからたくさん回収したとき、液量がたくさんになるからと、複数匹50mlのチューブ数本集めた時予想より少なくなりました。その時はベンチ内（RT）時間がかかったから死んだ細胞が多くなったのかなとおもいましたが、1,2匹で予備実験からの予想数の60％まで落ちたことがあります。あまりにひどいので、次の時分けてチューブも15mlとか5mlで（トータル時間はさらにかかりましたが）やったらそこまでの減少はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4546-10 - 2007/07/19 (木) 11:06:51 - えんしん あまり詳しくて申し訳ないですが、私が採取していたPrimaryの上皮系は遠心で落ちにくいものがありました。 そのときは、600（〜700）xｇ　で 2(〜4)min　くらいで上げました。 もしかするとナンセンスかも知れません。。。。

Re:細胞はどこへ？ 削除/引用 No.4546-9 - 2007/07/18 (水) 16:17:53 - アシタカ えんしんさん >遠心がまだ弱いとか？もうちょっと強くしてみては？ 300xg, 6分でも弱いでしょうか？ 細胞にもよるでしょうけれど、細胞にダメージが出てくる遠心って、 どのくらいの条件なのでしょう？ これより強い遠心を行っている方いらっしゃいますか？ しまさん > 細胞懸濁液を入れる前に、チューブをぬらしておくということ これは初めて聞きました。 下記の実験ステップで、15mlのチューブに移しているときには ぬれていません。今度は一度バッファーを入れておこうと思います。 またバッファーや培地にFCSやBSAが含まれている方がいいようにも 思うのですが、チューブメーカーからすると、タンパクなどは 低吸着なので、どれほど効果があるかわかりませんという話でした。 別の実験で、例えば293Tなどを同じチューブで洗浄していても ペレットが少なくなっていくことはありますので、遠心後に 細胞が浮遊しているかはわかりませんが、細胞を吸ってしまっている 可能性が高いかな？と思っています。

チューブに着いていませんか？ 削除/引用 No.4546-8 - 2007/07/18 (水) 10:11:34 - しま 以前、ヒトPBMCやマウス骨髄細胞を採取していたことがあります。 技術移管のときに注意されたのは、細胞がチューブの壁に付くので、 細胞懸濁液を入れる前に、チューブをぬらしておくということでした。 わたしは、採取の段階ではFCS入りのRPMIを使用していましたが、 最終的にはserumフリーDMEMにする必要があったので、 FCS入りRPMIの上清を取っておいて、チューブを変える際には、 必ず壁面を濡らしてから使用するようにしていました。 参考になれば…

(無題) 削除/引用 No.4546-7 - 2007/07/17 (火) 18:46:51 - えんしん 遠心がまだ弱いとか？ もうちょっと強くしてみては？

Re:細胞はどこへ？ 削除/引用 No.4546-5 - 2007/07/17 (火) 11:30:01 - アシタカ 皆さん、ありがとうございます。 上清の除去は、ポンプを介してピペットで吸引していますが、ペレットには近づかず、 かなり液を残すようにはしています。 例えば、50mlチューブを使ったような時には、多少斜めにして、液面がチューブの slant部分にきたあたりでやめていますので、液量として3-4ml程度は残っているでしょうし、 ペレットからも1cm以上は離れていると思います。 ただストレート部からslant部になったあたりにも、細胞が付いているようであれば 吸っているかもしれません。 細胞は、293Tをよく使っていますが、先日は、ヒト末梢リンパ球でした。 リンパ球に抗体と磁気ビーズを反応させ、MACSのカラムにかけるのですが、 下記のようなステップで行ったところ、３回の遠心、上清除去で半分を 失ってしまいました。 1. 細胞数計測：4×10exp7 cells/50ml of PBS in 50ml tube 2. 遠心 3. 懸濁：14ml 0.5% BSA, 2mM EDTA/PBS/15ml tube 4. 遠心 5. ミルテニーの抗体とビーズを反応 6. 懸濁：8ml 0.5%BSA, 2mM EDTA/PBS/15ml tube 7. 遠心 8. 懸濁：2ml 0.5%BSA, 2mM EDTA/PBS/15ml tube 9. 細胞数計測：2×10exp7 sorette さんが書かれているように、浮遊している細胞、あるいは ペレットにならずに軽くチューブ表面に付いている細胞が意外と 多いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.4546-4 - 2007/07/14 (土) 18:43:49 - 名無し その細胞は浮遊系ですか？付着系ですか？。洗った後は、細胞をどうするのですか？

(無題) 削除/引用 No.4546-3 - 2007/07/14 (土) 17:11:13 - sorette ペレットになった細胞は上清吸引の際に、一見吸ってなさそうでも、確実に吸われていきます。あらかたポンプで吸引した後、ピペットでペレットぎりぎりまで吸った上精を観察してみて下さい。かなり細胞が吸われているのがわかるとおもいます。細胞を全く吸わずに上清をとるのはほぼ無理でしょう。培地成分を除去したい余りペレットぎりぎりまで吸っていたらなおさらに思います。どれほど厳密な実験をされているかは存じませんが、ぎりぎりで吸うのは少し妥協して、洗浄に使うPBS量を増やして希釈率を高めたらいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4546-2 - 2007/07/14 (土) 15:16:52 - G 単純に、遠心後の上清廃棄の時に ペレットをちょっとずつ吸ってるんじゃないですか？

細胞はどこへ？ 削除/引用 No.4546-1 - 2007/07/14 (土) 14:23:31 - アシタカ ヒト、マウス由来のよく使われている培養細胞を使っています。 培地成分の持込を極力避けたいため、細胞をPBS(-)で洗浄していますが、 ３回ほど繰り返しますと、明らかにペレットが小さくなります。 50ml,15mlのポリプロピレンチューブ表面に付着した？とも考え、 顕微鏡で観察してみましたが、ぺちゃぺちゃと付いているようにも見えません。 細胞数をカウントすると、半分くらいになってしまうこともあります。 本来はタンパク成分を入れたくないのですが、別の実験で0.5%BSAを 含むPBSで洗った時にも少なくなりました。 遠心条件は、通常220xg, 3分ですが、300xg, 6分にしても あまり変わらないようです。 こういうことを経験されている方、いらっしゃいますか？ また対処方法はありますか？

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