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BAC sequence　について. トピック削除
No.4559-TOPIC - 2007/07/17 (火) 17:09:37 - ケビン（日本人）
現在私たちの研究室では、BACにある遺伝子を組み込んで実験に用いようとしています.

遺伝子を組み込んだ後に、sequenceを確認するために
『ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER』と『BigDye terminator v3.1 sequence kit』
を用いています.

現在下記の条件で、sequenceを読むことができるのですが、できれば『Reaction Mix』の使用量をより減らせないかと考えております.
そこで、アドバイスをお願いいたします.


＊現在、行っている条件.

Reaction Mix 4.0 uL
template 1.0 ug
primer 7.0 pmol
5×Sequencing Buffer 8.0 UL
millQ
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total 40 UL
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情報ありがとうございました. 削除/引用
No.4559-7 - 2007/07/23 (月) 08:36:44 - ケビン（日本人）
一度試してみます.

また、新たな情報があったら是非よろしくお願いします.

(無題) 削除/引用
No.4559-6 - 2007/07/18 (水) 11:30:07 - 奴隷
お恥ずかしい。DMSOはformamideの間違いです。

40uLのスケールで反応したものをEtOH沈殿で回収し、20uLのformamideに溶解したものを機械に掛けておられるということですね。

その条件でしっかり読めると言うことであれば、反応スケールを20uL、formamideを10uLにしても、反応溶液の組成も産物濃度も変わらないので、理想的には今までと全く同じ結果が期待できます。

この条件では、実はEtOH沈殿の時にかなりのロスが生じています。そこで、EtOH沈殿の時に共沈剤（carrier）を入れることで回収量の改善を図っています。LPAはlinear polyacrylamideのことでよく使われる共沈剤ですが、無蛍光のものであればこれに限りません。私たちは0.5% LPAをチューブ当たり1uL加えてEtOH沈殿しています。効率が良いので、EtOHを加えて混合したら即遠心して大丈夫です。冷やす必要もありません。

これで産物の回収量の改善が期待できるので、反応スケールをさらに半分の10uL（組成は変えない）にしても大丈夫だと思います。

LPAは市販されていますが、自作するのも容易です。一度作ると一生分できます。
http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4800/4740.pdf

Gaillard C, Strauss F.
Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier.
Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):378.

みなさん、ありがとうございます。 削除/引用
No.4559-5 - 2007/07/18 (水) 11:12:53 - ケビン（日本人）
『奴隷さん』に確認と質問なのですが…

DMSOを用いているのは、sequencerにかける直前のことでしょうか？
私たちの研究室では、昨日書かせていただいたPCR反応の後、
EDTA/EtOH沈を行い、最終的にHi-Dye formamide 20 uL に溶かしておこなっております。
どちらのほうが感度が良いという情報はありますか？

確認ですが、系を1/4にして反応させているとの事ですが、templateがplasmidではなくBACにおいての反応でしょうか?
そのときの、PCR反応はどのような条件になるのでしょうか?

あと、LPAが何かわからないので教えてください。

質問攻めになってしまって申し訳ありませんが、ご教授願います。

(無題) 削除/引用
No.4559-4 - 2007/07/17 (火) 18:36:12 - ケチケチ
Reaction Mix の希釈でしたら、
以前のトピがありました。

参考にしてください。

http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=10;Code=1081

(無題) 削除/引用
No.4559-3 - 2007/07/17 (火) 17:48:50 - Ｔ
total volume は 10ul で十分です。
以下のプロトコールを使えば、BigDye の使用量が減るだけでなく反応時間も劇的に短くなります。

Improved DNA sequencing quality and efficiency using an optimized fast cycle sequencing protocol
Adam R. Platt, Robert W. Woodhall, and Alfred L. George, Jr.
BioTechniques 43(1), 58-62, July2007

BAC では試したことはないですが、プラスミドでは問題なくうまく行っています。

(無題) 削除/引用
No.4559-2 - 2007/07/17 (火) 17:48:45 - 奴隷
それをどれだけの容量のDMSOに溶かしていますか？310ならサンプルトレーの位置合わせをきちんとしておけば、10uLでも余裕だと思います。

私たちはお示しになっている条件を、濃度は変えずにスケールを1/4に反応をしています。さらにLPAをキャリアにEtOH沈殿を行って、10uLのDMSOに溶かして機械に掛けています。

BAC sequence　について. 削除/引用
No.4559-1 - 2007/07/17 (火) 17:09:37 - ケビン（日本人）
現在私たちの研究室では、BACにある遺伝子を組み込んで実験に用いようとしています.

遺伝子を組み込んだ後に、sequenceを確認するために
『ABI PRISM 310 GENETIC ANALYSER』と『BigDye terminator v3.1 sequence kit』
を用いています.

現在下記の条件で、sequenceを読むことができるのですが、できれば『Reaction Mix』の使用量をより減らせないかと考えております.
そこで、アドバイスをお願いいたします.


＊現在、行っている条件.

Reaction Mix 4.0 uL
template 1.0 ug
primer 7.0 pmol
5×Sequencing Buffer 8.0 UL
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