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7878さん 削除/引用 No.4589-7 - 2007/10/22 (月) 14:16:27 - mom 追加情報ありがとうございます。 ＞その後ABIに再度確認したところ、ユーザーブリテンの例題はmomさんの指摘どおり、1個体から6チューブ作っているとのことです。 う〜ん、やはりそうでしたか。でも、1個体から3チューブならともかく、6チューブなんて、普通やらないですよね。だから紛らわしいんですよ。 ＞あと、この例題のデータを各群6個体とみなし、平均値、sd、分散、例数のみ使用してANOVAを試みたのですが、郡内平方和＋群間平方和＝全体の平方和となるはずが、どうしてもイコールにならないため先に進めず、挫折してしまいました。 あれ、できないんでしたっけ？？？すみません、ちょっと今余裕がないので、この件はもう少し考えさせてください。わかりましたら、「relative standard curve methodの統計処理について（続）」として新フォーラムの方へ投稿します。もし、7878さんの方で他に何かありましたら、新フォーラムで続けてください。リアルタイムPCRの統計処理に関しては、広く使われている手法のわりに謎の部分が多いと思っており、今後も色々なご意見を頂きたいです。

追加情報 削除/引用 No.4589-6 - 2007/10/20 (土) 02:07:38 - 7878 まだ投稿できるようなので、追加の情報を投稿します。 その後ABIに再度確認したところ、ユーザーブリテンの例題はmomさんの指摘どおり、1個体から6チューブ作っているとのことです。 こうなると各群に6つの値があっても1個体（n=1）としてのデータになるので、そもそもanovaなど統計解析には例数が足りないのですよね。 あと、この例題のデータを各群6個体とみなし、平均値、sd、分散、例数のみ使用してANOVAを試みたのですが、郡内平方和＋群間平方和＝全体の平方和となるはずが、どうしてもイコールにならないため先に進めず、挫折してしまいました。

少し整理できてきました 削除/引用 No.4589-5 - 2007/07/27 (金) 12:44:03 - 7878 momさん＞ すみません，リンクがおかしかったみたいですね。 参考にしているユーザーブリテンは同じものです。 CV値以降の計算はエクセルで各自行う仕様のようです。 ＞各tissueについて測定値が6つありますよね…。1個体から1サンプルとったとして、6個体からのデータでしたら、個体毎にc-myc/GAPDHを求めるべきではないでしょうか。1個体から6tube作ったのなら、どのtubeとどのtubeをペアにすべきかはわからないので（同一tubeなら同じ tubeのデータで割ればOK）、平均値を平均値で割ることになります。 確かに一個体から6チューブ作ったと考えれば，納得できますね。私はてっきり各サンプルデータは既にtriplicateした平均値から算出されているのだと思い込んでいました。そうすると6チューブの平均値をそのサンプルの真値として扱い，c-mycの平均値/GAPDHの平均値でそのサンプルのノーマライズが行われ，それを有意差検定に持ち込めるわけですね。そうなると，「各サンプルのCV値」を計算してそこから「各サンプルのSD値」を計算することに意味があるのだろうか・・・。欲しいのは対象群あるいは処理群としての平均値とSD値ですし。 ＞ABIに逆らうようですが、ひとつ前のレスであげたトピックで話題になっているように、「個体間の誤差」と「tube間の誤差」を一緒くたにして処理することは間違っていると思われるからです。 わたしもこの意見に同意です。 ＞ただ、問題なのはC.V.からS.D.を求めている理由のような気がします。このS.D.を使って検定するとなると、生データから普通にパラメトリック検定するのとは結果が違ってきそうです…。ユーザーブリテンに記載されている範囲のことでも、問い合わせに応じてくれないのでしょうか？？？ そうなんです。近い値にはなるでしょうが，データのバラツキ具合によっては示される値が大きく変わりそうですよね（まだ試してないですが）。 問い合わせに関しては質問の仕方を変えればもう少し情報を得られたかも知れません。返事を転載すると，「統計学的な手法に関しては研究者の方により考え方が様々ですので、サポート対象外とさせていただいております。大変恐縮ですが、ご了承ください。」と言うことで，ちょっと質問の仕方が悪かったかもしれないです。

間違えてました 削除/引用 No.4589-4 - 2007/07/26 (木) 12:08:48 - mom 私が参照したのはUser Bulletin #2 ABI PRISM 7700のpage 15 of 36の表です。Comparative CT Method (Separate Tubes)の章に入っているので、標的遺伝子と内部標準遺伝子は別tubeで測定しますが…standard curveを使っていませんね。失礼しました（＾＾ゞ （7878さんの質問で表示されているURLへ飛べなかったので、見ているものが同じかどうかわからないのですが…）改めてRelative standare Curve Exampleをみてみました。 なるほど、一旦C.V.を求めて、C.V.からS.D.を計算しているのですね…何故なんでしょう？ΔΔCt法では普通にS.D.を求めているのに、検量線から計算したデータでは平均値の大きさがS.D.に影響するから、バラツキをCVで求めておいて平均値に合わせてS.D.を求める…？自分で言っててわけわかんなくなってきました。対数と真数を行ったり来たりしているところがやっかいなのでしょうか…？ みなさん、この方法で計算しているのでしょうか？あ、ここのソフトを使うと自動的にこういう計算がされるのかな？ ところで、読み飛ばしているのかもしれませんが、各tissueについて測定値が6つありますよね…。1個体から1サンプルとったとして、6個体からのデータでしたら、個体毎にc-myc/GAPDHを求めるべきではないでしょうか。1個体から6tube作ったのなら、どのtubeとどのtubeをペアにすべきかはわからないので（同一tubeなら同じtubeのデータで割ればOK）、平均値を平均値で割ることになります。 ABIに逆らうようですが、ひとつ前のレスであげたトピックで話題になっているように、「個体間の誤差」と「tube間の誤差」を一緒くたにして処理することは間違っていると思われるからです。 ただ、問題なのはC.V.からS.D.を求めている理由のような気がします。このS.D.を使って検定するとなると、生データから普通にパラメトリック検定するのとは結果が違ってきそうです…。ユーザーブリテンに記載されている範囲のことでも、問い合わせに応じてくれないのでしょうか？？？ あと、ANOVAの計算の件ですが、各群の例数・平均値・分散と全体の例数・平均値・分散がわかれば計算できたと思いますが、各群の各群の例数・平均値・分散から全体の分散が計算できたか？というのが記憶にありません。計算式を確認してみればよいのでしょうが、今はちょっとできません。すみません。

ありがとうございます 削除/引用 No.4589-3 - 2007/07/26 (木) 03:06:32 - 7878 momさん＞ レスありがとうございます。 momさんが例にされているのはΔΔCt法ですね。別々のチューブで行われる検量線による相対比較法とはちょっと違いますが、勉強になります。 ＞有意差検定を行うには、平均値と標準偏差とn数があればOKです。ソフトによっては生データを入れないと計算できないかもしれませんが、t検定くらいなら手計算（といっても計算はExcelか何か使うでしょう）で十分できます。 そうなんですか。知らなかった・・・。今までstatviewなどの専用ソフトに頼っていたので生データを使用しないとできないものだと思ってました。anovaも平均値と標準偏差とｎ数があれば生データがなくても解析できるのでしょうか？だとすれば、この問題は解決ですが。 ＞どの数値を使ってどういった検定をするか、ですよね。 そうなんです。私の場合、特に知りたいのは標的遺伝子と内部標準遺伝子の各群の平均値同士をノーマライズした値でanovaなどの検定が可能なのか？です。 ΔΔct法の場合、各サンプルのΔct値を使って統計処理できると他のスレッド（http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3168）で読んだことがありますが、標的遺伝子と内部標準遺伝子を別チューブで行うrelative standard curve法の場合も同様に個体ごとにノーマライズした値で統計処理して問題ないのか（明らかにブリテンのノーマライズ方法とは異なります）、問題なら何がどの程度問題になるのか、それがいまいち分からないのです。 ブリテンにも掲載されている同一チューブ内で標的遺伝子と内部標準遺伝子を測定する方法では、各サンプルについて標的遺伝子／内部標準遺伝子という値を計算しているので統計処理には困らないですが・・・。 ABIに聞いても「統計処理はサポート外」で逃げられてしまいました。

わかっているわけではないのですが… 削除/引用 No.4589-2 - 2007/07/25 (水) 10:56:06 - mom 私もこの件について、皆さんが現実にどう処理しているのか、凄く知りたいのですが…なかなかレスがつかないようですね。 私の分る範囲のことを書きますので、間違いあったらどなたか指摘していただけるとありがたいです。 ユーザーブリテンのやり方では 1)ΔCtの標準偏差を（c-mycの平均値）^2+(GAPDHの平均値)^2の平方根で求めています。 （AのB乗をA^Bと表記します。（）^2は（）内の値の二乗です。） c-mycの平均値／GAPDHの平均値はCt値の引き算で得られるので、分散の加法性に従って標準偏差を求めています。 2)brainを1として各群の比率を出すには、まずbrainのΔCtを各群から引いてΔΔCtを求めます。 ΔΔCtの標準偏差は、ΔCtの標準偏差と同じです？！brainのΔCtは定数値として扱っているようです（←これが私にはなんだか不思議）。 3)ΔΔCtは対数変換された値ですから、2)の時点ではbrainの値は0です。これをbrainに対する相対値（比）に直します。 2^(-ΔΔCt）を求めます。（brainの値は1) ここで、標準偏差ですが、対数値を変換するときに2)の±S.D.の値（1)のS.D.と同じ値）を使って±2^(S.D.)としそうですが（しないかな？）これは間違い。 2^-(ΔΔCt-S.D.）と2^-(ΔΔCt+S.D.)を求めなければなりません。 さて、有意差検定を行うには、平均値と標準偏差とn数があればOKです。ソフトによっては生データを入れないと計算できないかもしれませんが、t検定くらいなら手計算（といっても計算はExcelか何か使うでしょう）で十分できます。 どの数値を使ってどういった検定をするか、ですよね。 対数変換されている Ct値（ΔCt,ΔΔCｔ）が正規分布に従っているのか、元に戻した3)の値が正規分布に従っているのか？で検定方法が異なると思います。 A)血中の薬物濃度のように「対数正規分布に従う」ことが前提となっていれば、対数変換した値をt検定などのパラメトリック検定できるはずです。つまり、前者の場合、1)あるいは2)の値を用いてパラメトリック検定を行えば良いことになります。1)でも2)でも結果は同じになります。さっき、2)のところでbrainの値を定数扱いするのが不思議と書きましたが、定数扱いいしないと1)と2)の検定結果が違ってしまいますね（その方が変ですね）。 B)元に戻した値が正規分布に従うのなら、3)でパラメトリック検定することになるでしょうか。数値の意味合いはこちらの方が分りやすいですが、数値の意味に拘らずに、対数変換などの変換を積極的に行う考え方もあるので、その辺はなんともいえません。 C)あるいは、3)でノンパラメトリック検定という手もあります。正規分布でないことがわかっている、分布がわからない、変換した値で検定したくない、などの場合でしょうか。 A)B)C)のどれが正しいか（全部間違っていたりして）、あるいはどうやっても同じなのか、同じではないのか、私にはわかりません。 私は色々と悩んだ末（？）、ΔΔCtではなくコピー数を求めて検定することにしました。 平均値で補正するのではなく、サンプル毎の値を求めてから検定していますが、これはこれで色々問題がなきにしもあらず、です。この辺は下記のトピックにも出てくるので参考にして下さい。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4544

relative standard curve methodの統計処理について 削除/引用 No.4589-1 - 2007/07/23 (月) 13:40:11 - 7878 リアルタイムPCRの方法の中で，ABIのユーザブリテン http//www.appliedbiosystems.co.jp/website/SilverStream/Objectstore/General/04303859rev.B.pdfに掲載されているrelative standard curveを用いた定量方法がありますが，この方法を用いたときに，どの時点のデータを有意差検定に用いて良いのか分かりません。 例えば，ブリテンでは brainをコントロール群としてlier, kidney, lungについて標的遺伝子c-mycと内部標準遺伝子GAPDHを用いて定量しています。 c-myc,GAPDHについて各群の平均値と標準偏差を算出し，各群のノーマライズ値は c-mycの平均値／GAPDHの平均値 で計算されます。この後CV値を算出し，brainを１として各群の比率と標準偏差を計算していますが，ここでわからないのは 各サンプル（各群6検体ずつ）ごとにノーマライズされた値ではなく，平均値をノーマライズした値でどのように有意差検定を行うのかです。 基本的なことではありますが，悩んでおります。 よろしくお願いします。

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