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Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-17 - 2007/07/27 (金) 17:03:43 - たろう たくさんのアドバイスをありがとうございました。 結局細胞をHEK293Tに変えたところ、ばっちりシグナルが検出されました。 最近、これまで使用していた細胞がマイコプラズマ感染を起こし、 新たに細胞を買い直したのですが、どういう訳かこの細胞の トランスフェクション効率や発現効率が著しく悪いようです。 お騒がせいたしまして申し訳ありませんでした。 また色々なご意見をくださった方々、どうもありがとうございました。

FLAG 削除/引用 No.4597-16 - 2007/07/26 (木) 15:41:25 - koutai SigmaからFLAGのポリクロも出ています。 FLAGM2よりは反応性が若干弱いですが、そんなに悪くなかったと記憶しています。今回のケースでうまくワークするかどうかわかりませんが、うまくいくといいですね。

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-15 - 2007/07/26 (木) 14:07:56 - たろう 実験の都合上N末の方が都合が良いので、 N末で動くようにしたいと考えています。 それでも、どうしようもなかったらC末にするしかないですかね。

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-14 - 2007/07/26 (木) 14:03:45 - たろう koutaiさん、ありがとうございます。 確かにシグナル配列の直後にtag配列がありますので、 そのようなことが起こっているのかもしれません。 シグナル配列とtagの間にリンカーを入れた方が良かったでしょうか。 ポリクロを使うと改善することがあるのですね。 試してみようと思います。 koutaiさんが使用されて、おすすめのFALGポリクロ抗体を 教えていただけるとありがたいです。

C末tagにしてみたら？ 削除/引用 No.4597-13 - 2007/07/26 (木) 13:57:21 - センター 通常は、receptorのタギングはC末にするものだと思われますがいかがでしょうか？N末だの投稿されてる先生方が言われているようになると思いますよ。私もreceptorを扱っておりましたが、すべてC末にタギングしておりましたが、もし良ければ参考にしてください。

FLAG抗体の認識 削除/引用 No.4597-12 - 2007/07/26 (木) 09:04:36 - koutai Igκのシグナル配列の直後にタグ配列があると、膜蛋白のN末部分が細胞外に出てシグナル配列が切られる際にタグ配列の一部も一緒に欠損してしまい、FLAG抗体がエピトープ認識できなくなり、WBで検出できないのかもしれません。（ほかのタグでそういう経験あります。そのときは抗体を変えたら解決しました。） 解決法としては 1．抗体を変える(ポリクロがこういうときは確実だったりします。） 2.このような時、抗体濃度を濃くするより、泳動するサンプル量を多くする。(タグの一部が欠損したものとそうでないものが混ざっていて、サンプル量を多くのせる事で抗体が認識できるようになるかもしれません。） 293TはTransfectionしたときHelaや、NIH3T3より発現量が多いので細胞を変えるのもいいかと思います。

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-11 - 2007/07/25 (水) 20:28:12 - たろう たとえsignal sequenceが分泌タンパク由来のものでも 発現させているタンパクが膜タンパクなら、大部分が培地中に分泌されることは 無いと思いますが、いかがでしょうか。 ですので培地を回収してwesternはやってみたことがありません。 本日293T細胞を用いて免疫染色をしたところ、 L929やNIH3T3に比べてかなり強く多くの細胞が染まっていました。 理由はわかりませんが、L929やNHI3T3では単に発現量がかなり低いだけなのかもしれません。 293Tを用いてwesternもしてみようと思います。

signal sequence 削除/引用 No.4597-10 - 2007/07/25 (水) 19:50:07 - MD 通りすがりのもので失礼します。 Ig kappaのsignal sequenceをお使いのようですが、これは分泌シグナルではないでしょうか？ だとすると目的のタンパクの大部分は培地中に放出されていると言うことになると考えますが、そのようなことはないのでしょうか？　 お使いの細胞の培地を回収してWBで試した経験はおありですか？ とはいえ、ある程度は細胞内にも存在すると考えるのが道理でしょうけど。 すみません参考にならなくて。

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-9 - 2007/07/25 (水) 16:26:08 - たろう アグリゲートを形成してゲルにスタックされる可能性もあるのですね。 私のみたいタンパクは30kDaほどのGPI anchor型のタンパクなのですが、 可能性としてはそのようなものもあるということなのでしょうか。 とりあえず、使用する細胞を変えて実験してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4597-8 - 2007/07/24 (火) 20:30:36 - 奴隷 トランスポーターの様な膜を何度も貫通している疎水性の高いタンパク質は、Laemmliサンプルバッファー中で煮沸するとアグリゲートを形成して、移動度が遅れたりゲルに入らなくなったりすることがあります。煮沸する代わりに37℃で15分ほど処理することで解決する場合があります。

(無題) 削除/引用 No.4597-7 - 2007/07/24 (火) 18:15:22 - K 目的タンパク質がめちゃくちゃでかくて(もしくはなんらかの原因で大きなって)、分離ゲルと濃縮ゲルの間にスタックされている なんてことはないですよね？

(無題) 削除/引用 No.4597-6 - 2007/07/24 (火) 16:02:53 - WALT すいません、間違ってリロードしてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.4597-5 - 2007/07/24 (火) 16:01:35 - WALT siganal sequenceということはreceptorかと思いますが、細胞膜上のプロテアーゼで細胞外ドメインが培養上清に切り出されてることは考えられないですか？ トランスフェクションされたものがすべて切り出されてるとは考えにくいのですが、、、。 別のFLAGのついた遺伝子をcontrolにしてやってみたらどうでしょうか？ あと免疫沈降で確認してみたらどうでしょうか？

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-4 - 2007/07/24 (火) 13:29:10 - たろう 早速のレスポンスありがとうございました。 プロテアーゼで切り出されていることは考えられますが、 westernのサンプルとしてcell lysateを用いているので、 検出できないことは無いのではないかと思います。 またサンプルの調整法ですが、RIPA bufferまたはCHAPS bufferを35mm dishに confluentな細胞に150 ul加え、ピペッティングの後、sonicationしています。 その後、氷上で1時間置いた後、10000rpm 10min遠心し、上清をwestern用のサンプルとしています。おそらくタンパクの可溶化は出来ていると思うのですが・・・。 別のコントロールや免疫沈降は試してみようかとは思います。

(無題) 削除/引用 No.4597-3 - 2007/07/24 (火) 12:54:58 - 名無し Western blotting のサンプルはどのように調製してますかというかいまの条件で目的の蛋白質は可溶化はうまくいってますか。抗体も問題なくて蛋白質もちゃんと発現してるっぽくてそれでWBでみえないということはモノが取れていないのではとかおもいました。

(無題) 削除/引用 No.4597-2 - 2007/07/24 (火) 12:45:43 - WALT siganal sequenceということはreceptorかと思いますが、細胞膜上のプロテアーゼで細胞外ドメインが培養上清に切り出されてることは考えられないですか？ トランスフェクションされたものがすべて切り出されてるとは考えにくいのですが、、、。 別のFLAGのついた遺伝子をcontrolにしてやってみたらどうでしょうか？ あと免疫沈降で確認してみたらどうでしょうか？

Western でFLAGが検出されません 削除/引用 No.4597-1 - 2007/07/24 (火) 10:49:11 - たろう いつも勉強させていただいております。 現在私が直面している問題の解決策をご存知の方がいらっしゃいましたら、 是非教えていただきたく思います。 現在N末にFALG tagのついたコンストラクションを培養細胞に強制発現させてwestern blottingで検出する実験をしております。Flag tagはIg kappaのsignal sequenceの直後に挿入し、目的のタンパクのengogenousなsignal sequenceを削ったものをFlagの下流に入れています。プロモーターはCMVです。これをL929細胞やNIH3T3にトランスフェクションし、24時間後にwestern blotting用のサンプルを調整し、anti-FLAG抗体(sigma M2)で検出しようとしても、何も検出されませんでした。同じ抗体を用いて免疫染色をすると確かにシグナルが確認できるのでコンストラクションに問題は無いと思います。co-transfectionしたGFPはよく光っているので、transfection効率が悪いことやloadするタンパク量が少ないとも考えにくいのです。lysis bufferをいくつか試しましたが、結果はかわりませんでした。このような状況でこれからどうしたらよいのか非常に困っています。同じような経験をした方や、何か良いアドバイスをお持ちの方がいらっしゃいましたら、是非教えてください。ちなみにコンストラクションにはkozak配列は入れていませんが、これが主な原因になったりするのでしょうか。 よろしくお願いします。

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