いつもお世話になっております。
現在、経費節約のため、ウイルス抗原のサンドイッチELISAを
構築しようと試みていますがうまくいきません。
ちょっと長くなりますが、方法は以下に示すとおりです。
１）100mM carbonate buffer (pH9.5)でcapture Abを固相化 (Nunc Maxisorp plate
4°C overnight)
２）PBS/0.05% Tweenでwash
３）TBS/1% skim milkでblocking (室温, 2hr)
４）PBS/0.05% Tweenでwash
５）DMEM/10% FBSで希釈した抗原をのせ 1/10 volumeの5% Tritonを加える (37°C, 2hr)
(ウイルスの不活化のためにTriton処理を行っています)
６）PBS/0.05% Tweenでwash
７）検出抗体をのせる (37°C, 1hr)
８）PBS/0.05% Tweenでwash
９）HRP標識2次抗体をのせる (37°C, 1hr)
１０）PBS/0.05% Tweenでwash
１１）TMBで発色
１２）1N HClで発色停止
１３）プレートリーダーで検出 (450nm)
ポジコンとして、以前使っていたKitに付属していたスタンダード抗原を用いていまして、
こちらの方はきれいに発色します。
しかし、新たに購入した抗原を同じ濃度に希釈したときには発色度合いが半分以下です。
これは買った抗原が悪かろうと思い、その会社に問い合わせたところ、
「ウイルス不活化に用いたfinal 0.5%のTritonが抗原抗体反応を阻害するとともに、
固相化の抗体がはがれているのだ」と言われました。
だとしたら、Kitに付属の抗原ではなぜ同じ事が起こらないのか疑問に思っています。
今後大量にELISAを行いたく、Kit付属のものはあまり残っていません。
従って、これがなくなる前に系の立ち上げが成功せねばと思っているのですが、
このような状態だと別の会社から抗原を買うしかないのでしょうか？
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