対象生物としてプラナリアを扱っています。
現在、LSCという蛍光顕微鏡にて観察するために、
細胞懸濁液をスライドグラスに広げて
蛍光染色した標本を作ろうとしています。
染色は抗体＋ヘキストで行う予定です。
細胞周期をヘキストで検出しつつ抗体で発現タンパクを見ようというものです。
しかしなかなかうまくいきません。
やり方としては簡単に言うと次のような感じです。
・メスで刻んでトリプシン処理→固定（4%PFA＋5%メタノール）
→フィルトレーション→スライドグラス上に滴下して風乾
・スライドグラスを切片標本と同様に染色
現在主に起こっている問題は
・切片標本ではきちんと染色できる抗体を使ってもうまく染まらない
・全体的にゴミ（壊れた細胞のかけら？）が多い
・小さな細胞がよりはがれているようで、細胞周期ごとの細胞数の配分が、
フローサイトメトリーの結果から考えられるものとかなり違う
生体から採取した細胞が生体内で存在する割合をできるだけ変えることなく、
最低15000個くらいを検鏡できるようにしなければなりません。
スライドグラスはマツナミのMASコートを使用していますが、
これ以外のコートはこれと比べてはがれづらかったりするでしょうか？
体感で、というのでも結構です。
他の二つの問題については、メスで乖離するときか、
固定した後風乾してスライドグラスを作っているときに、
細胞が壊れているのかと考えています。
ただ、乖離プロトコルは、同じ生物を使ったフローサイトメトリーで
当研究室ゆかりの方が確立されたものでして、
問題があるとしたら固定方法かスライドグラスの制作方法だと思います。
乖離細胞を固定するのにおすすめの固定方法はありますか？
Relaxantは試して芳しくない結果を数度得ています（ゴミだらけ、抗体染まらず
これまで実験指導教官他のすすめに従い
スライドグラスに置く前に固定してきましたが、
他の固定方法も試してみるにあたって、固定との順番も変えて
試してみようと考えています。
（細胞塗抹標本作製のプロトコルで、塗りつけてからガラスを固定液に浸けるというのも見たので）
何かここを改善してみたらどうかというところがありましたら
教えていただけると助かります。 |
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