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あいうえお様 削除/引用 No.1018-13 - 2008/04/25 (金) 08:09:50 - mikan ありがとうございます。 ボイルの温度を下げてみます。 非たんぱく系のブロッキングを試してみよう！！ と試薬を探しましたが、かなりお高く、 ゼラチンと研究室にあった、アンチラビット（goat 血清) でかなりきれいにWBできたので当面どちらかで おかなわれる予定です。 　 a-1は頂いた抗体で希釈濃度わ分からず慣例や参考文献通りの 濃度で希釈していましたが、バックが高く、1次抗体濃度が 高いのかもしれないようなので希釈濃度を変えてみます。 みなさま。 本当に感謝しています。 ありがとうございました！！ またよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1018-12 - 2008/04/24 (木) 10:40:08 - あいうえお Na/K-ATPaseの場合はしりませんが、 良く似たH/K-ATPaseの場合、サンプルを denatureする時にボイルすると アグってしまい、うまく泳動できないようです。 膜タンパクの場合は良くあることのようです。 サンプルをボイルせず50℃、20分くらいで denatureさせるのが対応策です。

おおさま 削除/引用 No.1018-11 - 2008/04/24 (木) 08:45:14 - mikan 本当ですね。 検出される量の違いがわかりやすいように とりあえず同じプロトコルでやってみたほうが 良いですね。 あまりにも抗体の性質が違うみたいなので どうしてもうまく行かなければ 手法をかえるしかないのかなぁ、、、 早速今からやってきます！！ありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.1018-10 - 2008/04/24 (木) 01:05:26 - おお 抽出段階、そのた色々な段階での指摘が結構出ていますがひとつ言えることは、ポジコンにあたるものがあるなら(培養細胞とか)そう言うのを使えば、どこの時点の問題か見極めやすいです。あと、燐酸化フォームとそうでないもの(燐酸化とそうでないも合わせたトータル)の比較ということですが、抽出、SDSPAGE、トランスファーなどの問題や改善を考えるなら、燐酸化とそうでないも合わせたトータルの結果をまず優先して見ていくことが望ましいのではと思います。 特に燐酸化フォームは組織の状態によっては燐酸化があまりされてなくて、薄くて当然かもしれませんから。 これらの事がだいたいうまくいっていると考えられるなら、ウエスタンの検出感度を考えて検出システムを変える事を次に考えても良いかもしれません。

感動しました。。 削除/引用 No.1018-9 - 2008/04/23 (水) 17:54:53 - mikan 今日はBSAでブロックしました。ゼラチンも 試していますミルクは一切抜きました。 これでダメならば非たんぱく系のPVP,PVA、（PEG)で ブロッキングをします。おお様ありがとうございます。 脂質が溶け込んでいる可能性は高そうですので 回収時にはA様に教えていただいた超遠心をしてみます。 中年様のおっしゃるように、ATPaseとPhosho のブロッティング後の条件を変えて、奇麗なバンド （今はとてもうすい、、）に仕上げたいと思います。 お仕事を教えてくれている方がもうすぐお引っ越しで、 とても優秀な人なので不安とプレッシャーがありましたが がんばれそうです。

(無題) 削除/引用 No.1018-8 - 2008/04/23 (水) 17:07:19 - 中年 たとえ同じ抗原に対するウエスタンであっても、抗体が異なればブロッキングの条件を同じにする意味はまったくありません。それぞれの抗体に最適化されたブロッキング条件を用いるべきです。

(無題) 削除/引用 No.1018-7 - 2008/04/23 (水) 16:38:52 - A > �@界面活性剤の入った、組織用の既製品の抽出液で > 動物の筋肉をホモジナイズしています。遠心して > 上澄みをWRと混合して加熱し電気泳動しています。 > （ここで落ちてる可能性もありますね。。） 遠心は超遠心ですか？もしそうでないのであれば 遠心後の上清が濁っているのでは？もしそうなら 超遠心をしないと界面活性剤で可溶化した脂質が 上清に混入して反応を妨げている可能性があります。 超遠心で蛋白質画分と脂質画分を上手く分離できたので あれば遠心後に上から黄色い透明な脂質画分、 透明な蛋白質画分、沈殿の順に分かれているはずです。 パスツールピペットを壁に沿わせて脂質画分を 乱さないように差し込んで中間の蛋白質画分を回収します。 加熱によって沈殿している可能性があるのであれば サンプルバッファーと混合後しばらく静置した後 （還元反応を促すため）煮沸しないでそのまま SDS-PAGEにのせてみては？煮沸したものと並べて 流してみると煮沸による沈殿が起こっているのか わかるかもしれません。 > �A抗体は既製品です。Na-K ATPaseとシグナル伝達のため > リン酸化されたNa-K ATPase（Phospho)を�@の材料を同じ条件で > WBしてバンドを見ようとしています。 既製品を使っているのであれば購入先のメーカーにブロッキング、 ポジコンなど詳しい条件を聞くことが出来るはずです。また自分の 状況をきちんとまとめて詳しく伝えれば良いアドバイスが得られる と思います。

(無題) 削除/引用 No.1018-6 - 2008/04/23 (水) 08:25:19 - おお 非タンパク性のブロッキング試薬として1%PVP(polyvinylpyrrolidone)を使うことがあります、特に燐酸化タンパクの検出はブロックに使われるタンパクが邪魔をすることがありますので、有効なことがあると思います。 詳しくはWEBとかで調べてみてください。もしかしたら島津がプロトコール持ってるかもしれません、ウエスタンで検出したあと、抗体をはがしてマスに持っていくというのをやってましたから。この時タンパク性のブロッキングはマスの邪魔になりますから。 もう一つはバックは一般的にPVDFよりニトロセルロースのほうが低いです。メンブレンの比較もやってみる価値はあるかと思います。 ミリポアのプロトコールでPVDFにトランスファーしたあと乾燥させてウエスタンをするというのがありました。PVDFは乾燥すると水を弾きますので、抗体がメンブレンにアクセスできないわけですが、たんぱく質が吸着した部分はしん水性なので水分、抗体がアクセスでき検出が可能という話です。実際にやったことはないのですが、なるほどと思いました。

皆様！！ありがとうございます 削除/引用 No.1018-5 - 2008/04/23 (水) 07:48:06 - mikan わ〜。お返事いただいて本当にうれしいです。 A様名無し様sea様！！天才ですね！！目から鱗です。 １年契約の研究員のため、先生がいないのです。 いろいろ教えていただけたらとてもうれしいです。 �@界面活性剤の入った、組織用の既製品の抽出液で 動物の筋肉をホモジナイズしています。遠心して 上澄みをWRと混合して加熱し電気泳動しています。 （ここで落ちてる可能性もありますね。。） �A抗体は既製品です。Na-K ATPaseとシグナル伝達のため リン酸化されたNa-K ATPase（Phospho)を�@の材料を同じ条件で WBしてバンドを見ようとしています。 BSAをブロックに使うとphosphoが汚れて MILKをつかうとアルファー１がよごれます。 ２種をブロックからの条件を変えて抗体をかけても よいような感じがしてきました。上司に聞いてみます。 サンプルの疎水性であるとか、、すごく勉強になります。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1018-4 - 2008/04/23 (水) 04:52:22 - sea 私も読んでてよく状況がわからないのですが、 文面から察するに、二つのタンパクを一度に検出しようと しているように見えるのですが、 まず一つずつ条件を設定してはいかがですか？ strippingしてからもう一つを検出してもいいわけですし。 WBではタンパクの抽出に始まって最後のシグナルの検出まで、 いつも議論になるように検討することも多いわけですが、 なんか基本的なところを押さえないまま一足飛びに 目的のことをやろうとしていて混乱してしまっているように 感じられます。 指導教官や先輩に相談してもう少しstep by stepで系を 確立するようにしてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1018-3 - 2008/04/22 (火) 21:00:11 - 名無しさん phosphoって何の事ですか？リン酸化アミノ酸残基の抗体？　アルカリフォスファターゼの系で検出という意味？リン酸化アミノ酸残基の抗体だとしたらたしかフォスフォセリンだとスキムミルクは×でしょ。あとNa-K- ATPaseだと、これはけっこう疎水性の強い膜蛋白質だったとおもうので、もし電気泳動前に加熱処理したらアグってゲル入らなくなるからこれもXでしょ。ブロッキングはBSAかゼラチンにして加熱なしでSDS-PAGEしてみたらどうでしょうか。 ふつう、細胞をSDS-bufferで直に溶かすのがいいと思うけど、もしも他のlysis buffer 使ってるなら今の方法で膜画分はとれてきてるのでしょうか。緩いlysis bufferだとそんな簡単に溶けないから、遠心したら沈殿に行ってしまうと思うので、大事な画分を捨ててるのでないかと気になります。

(無題) 削除/引用 No.1018-2 - 2008/04/22 (火) 20:39:04 - A 混乱しているのは文章から読み取れるのですが状況がよくわかりません。 もう少しわかりやすくまとめて書き込みなおしてください。 私はこれらの蛋白質について詳しく知りません。少なくとも知りたい情報は １．どのようにサンプルを調整したのか？ 　　組織から抽出したのかリコンビナントなのか、精製したものか 抽出しただけなのかなど。 ２．抗体は市販品なのか自分たちで作ったのか？ ポリクロなのかモノクロなのか、精製した抗体なのかなど。 ３．ポジコンは何を使っているのか？ ４．WBの詳しいプロトコールは？ ブロッティングの条件、ニトロセルロースそれともPVDF膜？ 抗体濃度、反応条件（温度、時間）。 ５．検出に使っている基質溶液は？ とにかく詳しい情報書き込んでもらえないとアドバイスのしようが ありません。

WBで、みたいバンドが薄くなってしまいます。 削除/引用 No.1018-1 - 2008/04/22 (火) 20:14:43 - mikan １次抗体に　Na‐KATPase a‐１　とPhosphoを使って、 WBをしています。ブロッキングに５％BSA0.３％MILKを使うと Phosphoのバックグラウンドがすごく黒くなって、 ブロックを１％以上のミルクにするとa-1(アルファーワン）の 方のバックが汚れたり、見たいバンドがとても薄くなってしまいます。 抗体のソリューションを高価な既製品を使用してみたり ３〜５％のBSAを混合したT-TBSを使ったりしていますが、 なかなかうまくゆかず、困っています。。。。 同じ条件で２つともきれいなバンドを見たいと思います。 初心者で頭がこんがらがっています。 良いアドバイスがあればよろしくお願いいたします！！

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