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(無題) 削除/引用 No.1031-9 - 2008/04/24 (木) 20:52:34 - A >[Re:6] Ｌanさんは書きました : > 一つだけ質問があるのですが、 > 組織と液体窒素を乳鉢に一緒に入れて破砕するという方法は > 何か参考になる論文はありますでしょうか？ > 残念ながら特に参考になる論文などは見たことありません。 とにかく組織が凍結していれば液体窒素の量は正確である必要は ないですし入れすぎても液体窒素は結局気化して飛んでしまうので その比に正確性は求められないでしょうから。仮にあったとしても 「肝臓組織は乳鉢中で液体窒素の存在下で破砕された。」ぐらいの 記述しかないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1031-8 - 2008/04/24 (木) 19:14:26 - うん 図書館に行けば、生化学実験講座という古い本が大抵はあるので、 その薬物代謝関連のところに詳しく書いてありますよ。 日本の伝統芸でしたから、へたな一流紙より水準は高いです。 名無しさんのいわれるように新しい論文では丁寧には書いてません。 IFとも関係ないです。 一点、未変性の生体試料を4度で日のオーダーで保存するのは まずいです。もし活性測定ならば、調整したらその直後に測らないと 活性の変動などは知ることができません。 Westerbnでも切られたりろくなことありません。 確かにSDS bufferに溶かしておくと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1031-7 - 2008/04/24 (木) 18:51:08 - 名無し CYPとかなら論文はいままでいろいろ出てると思うし、使うのは大抵、肝臓だろうから、さっと10報くらい読めばばどんな方法がスタンダードかすぐ分かるように思います。参照する論文のimpact factorや論文の新旧がどう関係なあるのか分かりかねます。最近出た論文だと方法のパートは、本質的にはーーーに書いてあるようにやりました、とか引用で終わらせている事が多いでしょうから、かならずしも新しいのがいいということもないでしょう。あと難しい雑誌は試料調製の仕方とかまであんまりちゃんと書いてないことが多いように思います。

皆さんコメントありがとうございます。 削除/引用 No.1031-6 - 2008/04/24 (木) 17:46:50 - Ｌan 肝臓のミクロソーム分画を採取したいのは、 薬物代謝関連酵素(CYP3A)の測定をするためです。 実験に関する詳しい説明が遅くなってしまい、すいません。。 PAGE sample bufferでやるやり方もあるんですね！ 全然知りませんでした。 もっとimpact factorの高い論文を探して 勉強してみます。 一つだけ質問があるのですが、 組織と液体窒素を乳鉢に一緒に入れて破砕するという方法は 何か参考になる論文はありますでしょうか？ もし分かったら是非教えて下さい、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1031-5 - 2008/04/24 (木) 16:26:29 - A > �B肝臓は切除し、かみそりでみじん切りにし、4倍体積の1.15%KCｌ中でホモジネート 組織や細胞をホモジネートする場合特に分解しやすい蛋白質が必要なら 組織と液体窒素を乳鉢に一緒に入れて破砕するという方法があります。 組織破砕の際に蛋白質が分解することもありませんし時間を気にせず 確実にホモジネート出来るというメリットがあります。後は破砕した 粉末状の組織を抽出バッファーで溶解し遠心します。 もちろん凍結によって目的蛋白質が不活性化しないことが前提になりますが 私の経験上で問題になったことは一度もありません。

(無題) 削除/引用 No.1031-4 - 2008/04/24 (木) 16:10:39 - 名無し 目的によってホモジナイズするときのbufferとか方法はいろいろだとおもうので、何をしらべたいのかある程度は書いたほうが良いと思う。。肝臓のホモジナイズするときはこれが一番です、はい、みたいな感じじゃなくて、はじめてやる時は、みんな、いろんな可能性を自分であれこれ考えたり、似たような研究の論文をいくつか調たりして、より良いと思われるbuffer組成とかを考えると思うし。 ミクロソーム画分を必要としているのですか。薬物代謝関連酵素とかそういうやつですか。

(無題) 削除/引用 No.1031-3 - 2008/04/24 (木) 15:23:34 - m 論文に載っている方法というのは、すでに実績のある方法ということで、 たしかにそれを参考にして実験を行うことが一般的です。 しかし論文は山のようにあるわけで、ウエスタンブロットをしてる論文の数も非常に多いです。 その際、自分の実験に最適な条件を見つけるためには、 実験の目的、使用組織、検出したい抗原の種類などができるだけマッチしている論文を参考にした方がよいことはおわかりいただけるでしょう。 今回、見ておられる文献では、 動物は空腹状態である必要があり、血液の成分が混じっては困るような実験目的（読んでないので何かはわかりませんが）で、ミクロソーム画分に多く含まれている、もしくはミクロソーム画分での発現量に差が期待されるような抗原を検出したかったのではないでしょうか。 あなたの実験がそれに合致しているのであればよいのですが、違うのであればまた別の論文を探すべきであると思います。 また実験自体以外では、データのきれいさ、論文の新しさ、ジャーナルのランクなども確認した方がよろしいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1031-2 - 2008/04/24 (木) 14:57:11 - りょう 分画している間にタンパクの劣化・サンプル間のバラツキなどが生じそうで怖いです。 ミクロゾーム画分を分取する必要があるのでしょうか？ total lysateを泳道するなら一般的に使用されるようなRIRA bufferあるいはdirectにSDS-PAGE sample buffer中でホモジナイズするというのでも問題ないと思います。

肝臓のホモジネートの方法 削除/引用 No.1031-1 - 2008/04/24 (木) 14:41:01 - Ｌan 初歩的な質問で申し訳ないのですが。。ウェスタンブロットに使用するマウスの肝臓の処理を文献を参考にやってみようと思うのですが・・ どなたかより良い方法があったら教えていただけますでしょうか?? 私が調べた方法は下記の通りです。 �@24hrs絶食後安楽死 �A肝臓は0.9%NaCl生理食塩水300ml以上で還流 �B肝臓は切除し、かみそりでみじん切りにし、4倍体積の1.15%KCｌ中でホモジネート �Cこのホモジネートを12000×gで25分冷凍遠心→沈殿を捨てる �Dミクロゾームは78000×gで90分超遠心によって沈殿させる �E硬く沈殿したミクロゾームはホモジナイザーを用いて1.15%KCｌに再懸濁させる →78000×gで90分遠心する �F洗浄されたミクロゾームは最後に1.15%KCｌに再懸濁させ、10mgタンパク/mlの濃度 にする ※この最終的なミクロゾーム懸濁液は4℃で保存し、2~3日以内に使う (The carbon Monoxide-binding pigment of Liver Microsomes The Journal Of Biological Chemistry vol.239 No7 July 1964より) もしご存知の方がいましたら、腎臓と小腸のホモジネートの仕方もご教授していただければ幸いです。

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