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コメントありがとうございます。 削除/引用 No.1032-8 - 2008/04/25 (金) 20:05:27 - ぶー 組織さん// ありがとうございました。 免疫染色といってもなかなか奥が深いと思いました。 もしご存知の方とお話しする機会がありましたら、 またコメントいただければありがたいです。 お忙しいところありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1032-7 - 2008/04/25 (金) 19:04:44 - 組織 > 凍結切片作製後からPFA固定でしか検出できないものがあり 未固定凍結で染まって、既固定凍結切片で染まらないというのは は不可解ですね。申し訳ないですが、私は経験したことがないです。 通常、未固定凍結組織を薄切後に固定する場合、固定までに少なからず抗原の劣化が生じているはずです。 したがって未固定凍結に比べて、既固定凍結切片の方がよく染まるというのが一般的です。 考えられるのは、薄切後固定で染めた抗原がデリケートで過固定になると染まらないという可能性でしょうか。 二重染色の問題は解決しませんが、薄切後固定無し、30分PFA固定、1時間PFA固定など固定条件を振って免疫染色し、シグナルの強さを比較してやれば、その抗原が過固定に弱いかを確認できると思います。

ありがとうございました。 削除/引用 No.1032-6 - 2008/04/25 (金) 15:55:05 - ぶー 組織さん// コメント本当にありがとうございました。 ふだん切片の厚みは５μｍを使用しており、今回のPGP9.5では20μｍのものを使用しました。 現在保有している抗体を灌流固定したものとしていないもので検出できるか試していますが、灌流固定でしか検出できないもの、凍結切片作製後からPFA固定でしか検出できないものがあり、共発現パターンの解析で困ることがあります。 灌流固定と切片作製後の固定では組織に対しどのような違いが生じているのでしょうか？ また、どのような抗体を使用する場合にこのようなことが生じるのでしょうか？ お忙しいところ申し訳ございませんが、もしご存知の方がいらっしゃいましたらお教えください。

(無題) 削除/引用 No.1032-5 - 2008/04/25 (金) 10:41:24 - 組織 一般的には、既固定凍結切片の方が抗原と形態の保持に優れています。 未固定凍結切片のメリットは、ターゲットの抗原に合わせて固定液を後から変えられる点です。 切片の厚さにもよりますが、未固定凍結切片を後からPFA固定しても、既固定よりも染まりが悪いことが多いです。 ちなみに還流固定は、浸透性の悪いアルデヒド系固定液をすばやく浸透させるための方法ですので、すぐに臓器を取り出せれば浸漬固定だけでもたいていの抗原は染まります。 使われている抗体が全てPFA固定で染まるのなら、先にPFA固定してから凍結包埋する方がきれいに染まると思います。

コメントありがとうございました。 削除/引用 No.1032-4 - 2008/04/25 (金) 09:43:03 - ぶー さっそくのお返事誠にありがとうございます。 (1) 使用した固定液は4%PFAで、いつも実験でも使用しているのと同様のものです。 (2) 固定後は組織を摘出し、3時間後固定を行いました。灌流固定は普段行っていないため、他の研究室の同期に手伝ってもらいました。さらに検討したところ、灌流固定しなくても組織を摘出してすぐに4%PFAに3時間つけてもシグナルが検出できましたので、最近ではそれを行っています。 (3) 凍結切片作製後の固定の場合は灌流固定で使用したものと同様の4%PFAで10分間行っています。固定時間も30分など条件をふりましたが．．． 他の固定液でも行ったり、賦活化も検討しましたがダメでした。他の抗体ではうまくいくんですが．．． 抗原の変性も考えたのですが、他の研究室の方々からPGP9.5はかなり安定しているものだから、他の抗体が失敗してもこれは失敗することはないといわれるほどで考えにくいかと思います。 ホルマリン固定パラフィン包埋切片ですが、当研究室ではin situハイブリダイゼーションも行っていて、シグナルが弱いため、凍結切片だと何とかいけるのですが、ホルマリン固定パラフィンだと厳しいため使用していません。 お忙しいところ誠にありがとうございました。お時間がありましたら、是非お返事ください。

(無題) 削除/引用 No.1032-2 - 2008/04/25 (金) 04:39:09 - sea 一般的な感覚では、ご指摘のとおり潅流固定で検出できたものが fresh frozenから作った切片であとで固定したもので検出できない、 というのはちょっと奇妙な感じがします。 ただ、念のためにいくつか確認していただけないでしょうか？ (1) 潅流固定で使用した固定液 (2) 潅流固定後の処理 (3) 凍結切片作成後固定の場合の固定液と固定時間 ご存知のように、免疫染色は固定法によってもだいぶ染まり方が 変わってきます。 固定法による違い、あとは固定前の凍結切片の処理によって 抗原が変性していないか、などの可能性はどうでしょうか？ ところで、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を 使う、というのはダメなんでしょうか？

固定法の違いについて 削除/引用 No.1032-1 - 2008/04/25 (金) 00:06:09 - ぶー はじめて書き込みをさせていただきます。 固定法についてどうしてもわからないことがありまして、ご質問させていただきます。 ふだん私はマウス、ラットの組織で凍結切片を作製し、免疫染色を行っており、組織摘出の際には灌流固定はせず、そのまま摘出したものをOCTコンパウンドに包埋し凍結切片を作製して、実験開始時に固定を行うという手法をとっています。 先日、この手法で神経細胞マーカーであるPGP9.5を染色したのですが、シグナルが全く見えませんでした。 他の方々の方法で検討したところ灌流固定を行ったもので切片を作製すると、シグナルをうまく検出できるという結論に達しました。 しかし、灌流固定を行った場合と行わなかった場合でなぜこのようなことが生じるのかがわかりません。 灌流固定を行わず切片を作製すると細胞の断面からタンパクが溶出してしまうなどが起こっているのでしょうか？ どなたか詳しい方がいらっしゃいましたらご教示ください。よろしくお願いいたします。

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