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ありがとうございます 削除/引用 No.1034-7 - 2008/04/28 (月) 16:38:47 - そら ＞名無しさん 　膜が透明になるなんてびっくりですね！ 　PVDF膜なので試してみたいと思います。 　ありがとうございます ＞TSさん 　膜に印をつけるという発想がありませんでした・・・ 　次回からやるようにします 　Wash bufferでもけっこう落ちてしまうので・・・ ＞Aさん 　今回はPVDF膜を使用しているので、ニトロセルロース膜の時やってみます 　Laemmliで煮るって面白いですね！ ＞sasukeさん 　本当に簡単ですね！試してみます！ 本当に色々なbufferがあるのですね〜 皆さんありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.1034-6 - 2008/04/27 (日) 14:32:21 - sasuke 0.2M NaOH 5分。 前後に水洗い。 簡単です。

(無題) 削除/引用 No.1034-5 - 2008/04/25 (金) 19:32:00 - A ニトロセルロース膜でですがSDS泳動バッファー（1xLaemmli）に漬けて 60度で30分ほど煮ると外れます。SDSの存在下で煮るのが重要らしいです。 後は泳動直後のつもりでブロッキングから始めてください。但しこれを やるとブロットした蛋白質も幾らか外れるようでシグナルは弱くなります。 ですから2度目のWBに検出感度の良い方の抗体を使ってください。

本題ではありませんが 削除/引用 No.1034-4 - 2008/04/25 (金) 15:18:41 - TS rainbowやdual colorのマーカーは、転写後に鉛筆でぽちっと軽く押しておくと良いかもしれませんよ。ストリッピングを繰り返すと、消えることありますよね。

追加 削除/引用 No.1034-3 - 2008/04/25 (金) 14:20:52 - 名無し 追加 PVDF膜をこの溶液に入れると膜が透明になりますが、水に戻すともとに戻りますからびっくりしないで下さい。いままで膜に結合した蛋白質がこの操作で外れて見えなくなった事はないです。もちろん全ての蛋白質でそうかどうかわかりません。あとこれはPVDF膜の話で、ニトロセルロース膜ではこの方法でやったことありません。

(無題) 削除/引用 No.1034-2 - 2008/04/25 (金) 14:13:10 - 名無し 膜を水で洗ってから6M 塩酸グアニジンと５％2MEを含む50mM Tris-HCl (pH6.8)溶液に入れて20~30分くらい室温で震盪して、それからまた水でよく洗って（15分x４回くらいかあるいはもう少し長く）から、またブロッキングへという感じでやってます。１回目のWBが終わった後、膜は水に漬けておき、乾燥させないようにして、早めに２回目をやった方がいいです。乾燥させてしまったり、はじめのWBのあと日数の経った膜はバックがきたなくなるときがあるので。

westernの抗体除去buffer 削除/引用 No.1034-1 - 2008/04/25 (金) 11:57:45 - そら いいbufferあったら教えてください。 今まで0.2Mグリシン(pH2.8)と62.5mM Tris-Hcl,100mM メルカプトエタノール,2% SDSの2種類のbufferを使っていたのですがあまり抗体の落ちが良くないです。 しかも後者の方は可視standardが消えてしまいます。 actinと同じ2次抗体でactinと近い分子量のものを同じmembraneでやりたいので・・・ すみませんが教えてください。

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