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ありがとうございます。 削除/引用 No.1036-5 - 2008/04/28 (月) 10:40:06 - T たいへん参考になりました。さっそく試してみます。

(無題) 削除/引用 No.1036-4 - 2008/04/26 (土) 19:31:28 - 核 ピアス社が蛋白質架橋剤をいろいろ出してますから、一度カタログを見てみて下さい。その中にあるDSPというのは細胞膜透過性があるため、細胞が生きた状態で細胞内蛋白質を架橋でき、かつ還元処理で架橋を切る事ができる可逆的な架橋剤です。生理的な状態で架橋できるので、アーティファクトのインターラクションも回避できるように思います。DNAとのクロスリンクの程度は少ないと聞いた事があります。 ホルムアルデヒドは反応性が強くいろんな蛋白質を修飾し抗原性を損なったり、CHIPでよく知られているように蛋白質ーDNAの架橋を起こすので止めた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1036-3 - 2008/04/26 (土) 12:58:40 - T 核さん、ありがとうございます。 リバーシブルな架橋剤は、どのようなものがありますか？ 素人ですみません。

(無題) 削除/引用 No.1036-2 - 2008/04/25 (金) 18:42:02 - 核 非イオン性、場合によってはCHAPSなどのイオン性の界面活性剤入れて、それと塩濃度を上げて、さらにDNAase I とRNase入れて少しの間インキュベートすれば大部分の核蛋白質は可溶化できると思います。昔からよく使われる方法なので核蛋白質関連の論文を調べればやり方は書いてあります。 核マトリクスだと、たぶんマイルドな方法では可溶化は無理とおもいます。 この種の実験での一番の問題は可溶化の際に複合体が解体してしまうかもしれないという事です。そのため、あらかじめリバーシブルな架橋剤でin vivoでクロスリンクしてから可溶化するやりかたがあります。このときはSDSなど強い変性剤も使えますから難溶性蛋白質でも有効です。そのあと免疫沈降ができるくらいまで非イオン性界面活性剤いりの適当なbufferに希釈して使います。この場合、DNAとの架橋が問題ですが、詳しくは知りませんが、学会で聞いた話ではその程度は架橋剤によりいろいろみたいです。 モノクローナル抗体を使う場合、エピトープが他のパートナー蛋白質の影にかくれてしまうと天然状態では免疫沈降できなくなるので、注意がひつようです。

核エキスを免疫沈降 削除/引用 No.1036-1 - 2008/04/25 (金) 17:03:56 - T 注目している遺伝子は、核にしか存在しません。これまでに報告されている会合分子との共免疫沈降を見たいのですが、核タンパクのほとんどは、普通のＲＩＰＡバッファー等には可溶化しません。 そこで、Pierce社などのNuclear Extraction Kitを用いて核を溶かした後に、そのまま免疫沈降反応を開始しようと思うのですが、経験がある方はいらっしゃいますか。 他にいい方法があれば、ぜひお教えください。

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