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(無題) 削除/引用 No.1037-7 - 2008/04/28 (月) 09:08:06 - 名無し トロンビンで切断したとき、切るべき所の他に、違う所も少し切れたのではないでしょうか。トロンビン切断条件を酵素濃度、反応時間などについて、３点くらいすこしおおきく幅をとっていくつか変えてみて、いま問題になっているバンドがどうなるか見てみたら。所詮は酵素ですから条件によっては変な所を間違えて切ることもあるでしょう。 ほかの可能性として、抗体を作った時の免疫動物は大腸菌蛋白質に対する抗体を持っている事はたまにあります。とくにウサギとか。粗抽出菌体蛋白質で前吸収してみたらどうなるかみるのもいいかも。トランスフォームしてない大腸の菌体ライゼートについてその抗体でWBしてみてもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.1037-6 - 2008/04/26 (土) 16:26:52 - sea すごく初歩的なことで申し訳ないのですが、 MWはどうやって決定していますか？ MWマーカーは信頼度の高そうなものを複数使って確認したり、 溶かしていますか？ 検出されたバンドのMWが確実に36kDa?、というところから スタートしないとその先に話が進まないような気がして。 たとえばよく使われるレインボーマーカーは バンドの幅が広くなりがちで、カラーがついているせいか バンドの位置も不正確であまり信頼していません。 同じメーカーから出ている二つのマーカーでも、ともに能書きには 正確な分子量の推定に、みたいなことが書いてあっても 実際に電気泳動するとバンドの位置がずれてしまって一致しなかったり することもあるので、MWマーカーの信頼度、というのも 大事な要素だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1037-5 - 2008/04/26 (土) 13:02:01 - AP 文面からは何が問題なのかよく伝わってこないのですが、 ＞目的位置の10kDa(大体35kDa)上に GST+目的タンパク質を発現、アフィニティー精製して、タグから切断したものを分離、目的タンパク質に対する抗体でウェスタンをしたら、 予想サイズが25 kDのところ10 kD大きい35 kDが検出された ということでしょうか。 段階ごとのサンプルでコントロールとっていますか。 ひょっとして、ライセートをアフィニティーカラムにかけて、カラム内消化、溶出してタグを切り離したタンパク質を得るというようなキットを使い、能書きどおり必ずうまくいくものだと決めてかかって、中間段階のコントロールをとっていなかったりしませんか？ 大腸菌の未精製ライセートや、カラム精製した未消化タンパク質でウェスタンすると、ちゃんと完全長のタグ＋目的タンパク質のサイズがでますか？また、それだけしかでませんか？ アフィニティー精製した融合タンパク質を消化してSDS-PAGEで確認すると、タグと目的タンパク質に完全消化されたバンドしかでませんか？また、よけいなところで切れて小さくなっているタンパク質はありませんか？（カラム内消化のシステムだとこの辺が確認しにくい）。 もし、そういうようなコントロールをとっているなら、その情報も出してもらえると、原因がもっと絞り込めると思います。 いまの情報からだけだと、極端な話、 ＞目的位置の10kDa(大体35kDa)上に これが、ちゃんと目的タンパク質25 kDが含まれている上で、 何かの原因でサイズが大きくなっているのだ、とは限らないのじゃないかと思います。 たとえば、目的タンパク質が完全長に発現していなくて10 kDでtruncateしていて、酵素によるタグの切断がうまくいっていない結果、GST 26 kD+ 10 kD = 36 kDが見えている、とか

(無題) 削除/引用 No.1037-4 - 2008/04/26 (土) 11:18:04 - うーん ただタンパクがアグッてるだけの可能性はないのでしょうか？ あるいは多量体を形成してしまうとか。 デグってしまって目的のバンドより小さくでたりすることはよくある気がします。 必ずしも（精製したものでも）ひとつのbandとか限らないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1037-3 - 2008/04/26 (土) 01:53:04 - おお 実際に発現している真核生物のライセートでウエスタンしたと言う事でしょうか。抗原として用いたポリベプチドが糖鎖を持ってなくても、糖鎖修飾されたタンパクを認識できる可能性はじゅうぶんありますよ。 もし、大腸菌から精製したポリペプチドでウエスタンしているなら、抗原とした精製ポリペプチドに含まれたいた微量の大腸菌由来のタンパクに対しても抗体が出来ていて、それがウエスタンでひっかかっているかもしれません。 対象の生物が大腸菌などでない場合、じゃまをしなければそのままでいいですけども、邪魔をすると思われる、あるいは懸念がどうしてもぬぐえない場合は、抗体を精製した方がいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1037-2 - 2008/04/25 (金) 19:25:50 - A まずGさんがおっしゃっているように糖鎖の付加はまずありえません。 >目的位置の10kDa(大体35kDa)上に、 これの意味が今ひとつはっきりしませんがGSTは26kDaですから「大体35kDa」 というのは35kDa+26kDa=61kDaのバンドが見られるということですか？ そうでないと融合蛋白質の目的位置が25kDa（26kDa以下）になってしまう ので。 SDS-PAGEで見られるバンドの位置はほぼMWに沿っていますが稀に本来の MWとは異なる位置にバンドが見られることがあります。私も一度だけ ある転写因子を発現精製した時にバンドの位置が常に配列から予想される MWと異なる位置に来るのを見たことがあります。その時は蛋白質が持つ 本来の電荷が極端に偏っている為に起こったのではと想像しました。 その蛋白質は元々共同研究者から分けてもらったプラスミドで彼らは抗体 を使ってそれが目的の蛋白質であると確認したそうです。 それであくまで私の想像ですが今回の場合もしかしたら目的位置よりも 10kDa高い位置にあるバンドが本来の融合蛋白質の全長で、MWから予想 される目的位置で見られるバンドは部分的に分解された融合蛋白質なので はないでしょうか。これを確認するには精製後の蛋白質のマススペクトル を確認するのが一番手っ取り早いと思います。申し訳ありませんが今の ところ他に良い方法が思いつきません。

GST融合タンパク質を用いたウエスタン時の目的位置以外のバンド 削除/引用 No.1037-1 - 2008/04/25 (金) 19:02:15 - G いつもお世話になります。 最近、pGEX-2Tを使って、GST融合タンパク質を大腸菌によって発現させ、目的タンパク質に対する抗体を使ってウエスタンブロットを行ったのですが、目的位置の10kDa(大体35kDa)上に、糖鎖？と思われるバンドが見られてしまい、困っています。融合タンパク質はトロンビンによる切断後、グルタチオンセファロースを使って精製しており、また根本的に大腸菌に発現させているので糖鎖はつかないはずで、このようなバンドは見られないはずなのですが理由がわかりません。どなたか、このような経験のある方がいらっしゃいましたら、どのように考えるべきか、どのように工夫するべきかアドバイスをいただけると大変助かります。ご教授よろしくお願いいたします。

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