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(無題) 削除/引用 No.1049-6 - 2008/05/10 (土) 18:33:16 - たた >具体的には16SrDNAを伸長するために・・・ >�@8F/1492R、�A27F/1492R、�B8F/519R >上記の3パターンのプライマーペアを試しました。 >�@と�Aは全く同じパターンを示し、 >�Bでは�@�Aのパターン＋更に別の非特異的産物が出てきます。 たぶん、�@�Aは単純にプライマーのせいじゃないかな。 �@と�Aで同じパターンを示すのは1492Rのせい。 1492Rがフォワードとリバースどっちにもくっついて増えてる（ノンスペ）。 1492Rだけ入れてPCRすると�@、�Aと同じパターンになるかも。 �Bはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1049-5 - 2008/04/29 (火) 09:59:30 - おお �@8F/1492R、�A27F/1492R、�B8F/519R この示している数字は、塩基のポジションですか? PCRプロダクトの長さをなるべく短くすると検出、感度の面でうまく行く確率が高くなると思いますよ。 検出方法にもよりますが、200bps以下場合によっては100ぐらいとか

(無題) 削除/引用 No.1049-4 - 2008/04/29 (火) 09:54:40 - おお まずテンプレード自身の問題であれば、プライマーなしでもバンドが出る可能せいがありますので、その辺を確かめてみてはどうでしょうか。 それをやった後で、スタンダードを作ってみてはどうでしょうか?ゲノム(マウス)にターゲットをいろんな濃度で混ぜていけばいいかと思います。そしてあなたの実験であり得る濃度でうまく行く条件を探すのがいいかと思います。確かに、プライマーによっては、特異的なシグナル(テンプレート)が減ると非特異が出てくる傾向があります。非特異がないのが理想的ですが、場合によってはあまりサイクル数を上げず、バンドか現れなくてもサザンブロットで検出する手もあります。低いサイクルであればある程度定量に信用性が保てますし。

(無題) 削除/引用 No.1049-3 - 2008/04/28 (月) 22:11:00 - ？？ マーカーサイズでどれくらいのものが何バンドでているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1049-2 - 2008/04/28 (月) 21:09:32 - うーん ではDNA templateの問題であるような気がします。 どのようにpreparationしていますか？ 精製してもなるんでしょうか？

PCRの非特異的産物 削除/引用 No.1049-1 - 2008/04/28 (月) 19:55:11 - milk 鋳型となるゲノムDNA中に目的塩基配列がない可能性が高く、 PCRを行っても非特異的産物が多く出てきます。 しかし、ここで私が疑問に感じていることは、 同じ鋳型DNAを用いてプライマーペアだけを変化させても、 生じる非特異的産物の電気泳動パターンが全く同じパターンを示すことです。 具体的には16SrDNAを伸長するために・・・ �@8F/1492R、�A27F/1492R、�B8F/519R 上記の3パターンのプライマーペアを試しました。 �@と�Aは全く同じパターンを示し、 �Bでは�@�Aのパターン＋更に別の非特異的産物が出てきます。 この現象をどう解釈すればよいなか悩んでおります。 どなたか知恵を貸していただけないでしょうか。 よろしくお願い致します。 【以下、補足です】 マウスのある組織にバクテリアルトランスロケーション(BT)が 起きているかどうかをPCR法で検出しようとしています。 実際にBTが起きているかどうかも分からず、 もし起きているとしても非常に微量な細菌しかいないために PCRで検出限界以下となっている可能性があります。 今回の非特異的産物はおそらくマウス組織のゲノムDNAを鋳型として 伸びてきた配列だと思うのですが、 何故プライマーペアを変えても同じパターンが示されるのかが不明です。 酵素はTakaRa Ex-Taq HSです。 ポジティブコントロールでは全プライマーペアで問題なく目的配列が 伸長できた条件を用いています。

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