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(無題) 削除/引用 No.1050-6 - 2008/05/02 (金) 12:21:41 - amits すいません、いただいたコメントの一つ一つが情報の洪水で、考えたり勉強したりしているうちに返信が遅れてしまいました。 ＞ラボに何があり、何が得意なのかによって、方法は変わってくると思います。 基本的に、たんぱくを取り扱うことにあまり馴染みのない研究室です。 CoIP-LC/MS/MSは、しばしば行われている、というくらいです。 ＞膜たんぱくらしい感じなので Flow Cytometryと、免疫染色で、細胞膜のたんぱくらしいことを確認しています。 ＞IPをせず、目的のバンドの位置にシングルのバンドがくる場合はゲルから切出しで十分ですし たしかに、粗精製をかませて、シングルバンドになる可能性もあると思いました。試してみます。 ＞ウエスタンのバンドがかなり特異性が高く、バンドもばっちりなのであれば、ウエストウエスタン法による発現クローニング そこまでばっちりではないです。ウェストウェスタンは難しい気がします。 ＞細胞表面にたいする抗体なら、パニング法とか。 検討してみます。 ＞2D-PAGE後に免染して位置を決めた後に、銀染でそのスポットを切り出して、MSにかけることも可能だと思います。 これだと、IPしなくても場所が決まりますね。検討してやってみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1050-5 - 2008/04/30 (水) 14:02:18 - ~ ラボに何があり、何が特異なのかによって、方法は変わってくると思います。 IP→SDS-PAGEで取れそうならば、 それはそれでいいと思います。 自作のモノクロで、たくさん作れるのでしたら、 2D-PAGE後に免染して位置を決めた後に、 銀染でそのスポットを切り出して、 MSにかけることも可能だと思います。 精製が特異なラボであれば、 ある程度のところまで精製してもいいでしょうけれども、 LC-MS/MSで、数個位のタンパク質フラグメントが検出される程度でしたら、 その全てを大腸菌で発現させてWBしてみた方が早いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1050-4 - 2008/04/30 (水) 12:13:47 - MS 抗原が発現してないと思われる細胞株（ウエスタンでバンドがでない？）を横に置いて精製を進めるのも、コントロールをとるという上では重要かもしれません。 それから、もしウエスタンのバンドがかなり特異性が高く、バンドもばっちりなのであれば、ウエストウエスタン法による発現クローニングも可能かとは思います。あと細胞表面にたいする抗体なら、パニング法とか。

(無題) 削除/引用 No.1050-3 - 2008/04/29 (火) 11:27:40 - おお >膜たんぱくらしい感じなので これがどの程度当たっているのでしょうか。先ず免疫染色で局在を確かめることによって、精製の方法の方針が立てやすくなる可能性があります。膜タンパクでもミトコンドリアや膈膜に非常に多く存在している状態なら、それぞれのオルガネラを単離した方がいいと思えますし。 IPして、目的のタンパクを濃縮するのは手ですが、やはり効率的にIPできて、かなりの量取れないと、バックグランドや、CoIPされてくる物との区別をどうしていくかと言うのが問題になってきます。それでもキャンディデートを絞れて、cDNAをえてタグ付などでひとつずつ可能性を見ていっても良いのですが、場合によってはごみばっかりを見ていると言う事になってしまうと、まずオルガネラや局在が分かるならそこから初めて、少し粗精製をかましてIPするのがいいかと思いました。 IPをせず、目的のバンドの位置にシングルのバンドがくる場合はゲルから切出しで十分ですし、メンブレンに移してから非タンパクせいのプロッキング剤でウエスタンをして、バンドが出たところを切取り、抗体をはがしたうえでマスというのも取れると思います。 まとめますと、個人的には先ず細胞全体のライセイトよりもフラクションを取ることにより、余分なタンパクを取らないようにする。フラクションのとり方は、免疫染色がワークしているなら、局在している部分がメインに取れる 方法をつかうか、メンセンがダメな場合は単純に膜フラクション、核フラクション、サイトゾルフラクションなどに分けて多く含まれるところを使う。 次に何かクロマトをかける(イオン交換か疎水クロマト、サイズフラクションはSDSPAGEでも出来るのでゲル濾過は効果的でない可能性があると思うので)その時点で一度精製度をチェクしてみて、IPで回収して可也精製できていると思えるなら、それをマスに持っていく。 IPしても自身がないなら皿に違うカラム(多分ゲルろ過以外)か等電点で精製すし、精製度やIPの可能せいを考える。または2次元でスポットを得、マスに持っていく。 こんな感じでしょうか、ワンステップずつ精製して、行けそうなところまで寄せていくのがいいかなと思えます。あくまでも個人的な考え方ですが。

(無題) 削除/引用 No.1050-2 - 2008/04/29 (火) 01:47:01 - こうたろー5 「膜たんぱくらしい感じなので、Lysisの条件をいろいろしながら、単純に、Protein A/Gのビーズで免疫沈降して、SDS-PAGEで銀染色でMSで・・・というような感じに進めています。」って言ってるんだから、その方法で決めちゃいなよ。 はいっ一件落着なりーーーー。

抗原不明抗体の抗原分子同定 削除/引用 No.1050-1 - 2008/04/28 (月) 22:54:48 - amits 抗原が不明のモノクローナル抗体の、抗原分子を同定したいと思っています。幸運なことに、どうもその抗原分子を発現しているらしい細胞株が見つかって(Western Blotで本物らしそうなバンドが見える)、たんぱく精製の原材料には事欠かなさそうです。 膜たんぱくらしい感じなので、Lysisの条件をいろいろしながら、単純に、Protein A/Gのビーズで免疫沈降して、SDS-PAGEで銀染色でMSで・・・というような感じに進めています。 あなたならどういう順番で精製を進めますか。

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