全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

有難うございました。 削除/引用 No.1055-4 - 2008/04/29 (火) 16:34:58 - Remon APさん、おおさん、貴重なアドバイス有難うございます！ 多少中間層が混じっても、その後にフェノール・クロロホルム反応を 繰り返す、アルコール沈殿を行う等、適切な対処をすることでクリアできる問題ということが分かり安心致しました。 今後、マウスの骨格筋といった微量サンプルでも行っていく予定ですので、 頂いたアドバイスをしっかり実践して、できる限りの収量を確保したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1055-3 - 2008/04/29 (火) 12:09:07 - おお わたしは、TRIZOLを使う時は示された量より多めに使うように心がけています。クロロフォルムを加えて遠心後ですが、その時点でわたしは中間層はなるべく残そうとしますが、たしょう中間層を拾ってもぎりぎりまで回収します。次に回収したボリュームに対して1/5ぐらいのTRIZOLを加えクロロフォルムを加えて遠心します。エッペン(1。5ml)でやっているなら先が細くなっているでしょうから、中間層から1/3の距離残してもボリュームで考えるとロスが少ないです。 最初のクロロフォルムを加えて遠心した際、可也汚いと考えた場合は、上清をなるべく完全に取ってクロロフォルムを何回かするか、少量のトライゾール添加、上清回収を何度か繰り返すようにしてます。結局最後の水層の回収だけ慎重にやって、あとはロスがないようになるべく完全に取っています。 場合によっては、クロロフォルムを加えて遠心後、慎重に取ってから、残ったTIROLの方に0。3M酢酸ナトリウムを加えボルテックス後遠心し、水層を回収し先に取った水層と混ぜてからRNA回収というのもしたことがあります。 丁寧にやるときれいなRNAがそれほどロスなく取れますが、サンプル数が増えるとしんどくなってきます。そうなるとカラムのキットの方が仕事という意味では効率的かと思えます。

(無題) 削除/引用 No.1055-2 - 2008/04/29 (火) 12:07:40 - AP 中間層にはタンパク質だけではなく大量のゲノムDNAがあるため粘性が高く 水層を吸い上げるときに中間層も一緒にひきずりやすいということがあると思います。水層を回収するときに中間層がねばーっと糸を引き、周囲の中間層が引きずれる様子がよく観察されます。 対処としては ・そういうものだと割り切って、水層を欲張ってとらないというのは一つの見識。 ・ポリトロンをかけたり、注射針を通す操作をしてゲノムDNAをよく剪断し、粘性を抑える。 ・多少中間層が混じってもいいから水層をしっかり回収してアルコール沈殿、それを再びTrizolで処理する。

フェノクロ後の中間層の形成が不安定な原因は？ 削除/引用 No.1055-1 - 2008/04/29 (火) 11:36:01 - Remon Total RNA抽出におけるフェノール・クロロホルム反応後の中間(変性タンパク)層の形成についての質問です。 TRIzolを用いてラット骨格筋(パウダー状にしてー80℃保存)からRNAを抽出しています。 プロトコルは、TRIzol説明書と同じようにしており、得られたRNAの260/280、260/230も特に異常な値ではありません。 しかし、クロロホルムを加えた後の遠心分離で形成された中間層(変性タンパク)がかなり不安定でもやもやっとした状態の為、水層を回収する際に最下層のフェノール・クロロホルム層が流れ込みやすいという現象が起きています。 そのため、回収しきれない水層を残したまま次の作業にすすんでおります。 フレッシュなパウダーを用いたり、パウダー量を変えたりなどしてみましたが、中間層の形成は不安定なままです。 なぜ、このような現象が起きるのか、どうすれば改善できるのか、ご存知の方がいらしゃいましたらアドバイス頂けないでしょうか。 かなり基礎的な技術に関する質問で大変恐縮ですが何卒よろしくお願い致します。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---