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(無題) 削除/引用 No.1056-3 - 2008/04/29 (火) 13:16:40 - ＴＸ おおさん アドバイスいつもありがとうございます。 マニュアル読んでるときれいなデータが出ると思い描いていたんですが、 なんかすっきりはしないですね。 おっしゃるとおり、結局in vitro, in vivoでの結合を証明しなければ意味がないわけで。とりあえず、酵母で結合部位同定する前に、GSTとTntシステム使って落ちるか検証してみます。

(無題) 削除/引用 No.1056-2 - 2008/04/29 (火) 12:36:32 - おお わたしはY2Hスクリーニングの時には、イーストで詳細なデーターを取らない方です。例えば3ーATとかの濃度をふれば陽性、陰性の境界はどこにでも引けますし、違うマーカーで見るにしても、イーストなどで違ってきますし人口的な系だから、擬陽性ぽくても生理的な条件(細胞のなかとか)ではそれなりに意味のある結合をしてるかもしれないとか、色々な可能性を考えるとY2Kのスクリーニングで拾えてきたものを、イーストないであれこれやっていてても始まらないからです。 Y2Kのシステムを放れて、もう少し生理的な条件で確認するほうがスッキリすると思いませんか? 結局擬陽性ぽくても、非常に興味がある遺伝子であれば、そういう流れにもなると思いますし。

two-hybrid retestにおける擬陽性クローン？ 削除/引用 No.1056-1 - 2008/04/29 (火) 12:18:14 - ＴＸ 現在、baitと相互作用する候補のpreyクローンをretestしているのですが、 陽性か擬陽性にするべきか迷ってるクローンがあります。 候補のpreyベクターをAH109に導入して、自家発光がないことを確かめました。これをY187に導入したbaitベクターとmatingしてDTOﾌﾟﾚｰﾄにて二倍体をセレクションした後、QTOﾌﾟﾚｰﾄにてgrowthとa-gal活性を指標にretestしました。コントロールとしてbaitを（humanLaminC、musp53,空）を用いました。 2日目にbait(目的）x候補preyはgrwoth+/青色を呈しましたが、このpreyはbaitが空BDのときにgowth（baitが目的のときよりもgrowthは悪い）が見られ3日目に青色を呈しました。このpreyがBDに結合すると考えるなら、LaminCやMusp53のときも同じくらいのgrowthとa-gal活性があると思うのですが、実際はLamiCやP53のときはgrowthやa-galは空BDのときのようにありませんでした（どのbaitでもgrwoth+/青色を呈す擬陽性クローン(分子シャペロンはありました。）。ちなみに、これらのbaitｘ空ADはgrwoth-でした。 このクローンは擬陽性、陽性どちらと判定すべきなのでしょうか？ 経験のあるかたアドバイス頂けたら幸いです。

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