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(無題) 削除/引用 No.1061-7 - 2008/04/30 (水) 11:25:58 - 細胞膜 ＞名無しさん、--さん、blotさん みなさま貴重なご意見ありがとうございます。 私の実験では、細胞内タンパク質とカドヘリンのような細胞膜タンパク質とのインタラクションを観察したいと考えております。 おっしゃるとおり、細胞膜タンパク質の局在を見る時だけは膜透過性処理を行わないで現在行っております。 ご指摘のとおり、膜タンパク質の観察ではやはり界面活性剤の処理は気になるところですよね。 みなさんの意見を参考に条件検討から入っていきたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1061-6 - 2008/04/30 (水) 10:00:04 - blot 他の方も書かれていますが、膜タンパク質を染色されるのであれば、なるべく膜の透過性処理は必要ないと考えています。 特に、Triton-X処理みたいな強力な処理は、お進めしません。 書かれていることでよくわからないことがあるのですが、膜の透過性処理をするということが前提ですので、細胞室内の部分をターゲットにされているということでしょうか？可能であれば、膜の外を認識する抗体に変更して、膜の透過性処理をしない方法にかえてみることが近道です。こうすることで、メンセンに対するクレームは、少なくなります。 しかしながら、どうしても細胞質の部分をターゲットにしなければならない特別な理由があったりする場合は、Triton-X処理ではなく、もっとマイルドな処理法を選ばれることがいいこともあります。 もちろん、タンパクによってはTriton-X処理で問題がない場合がありますので、Triton-X処理でどうしても膜の透過性処理をされるのであれば、他の方が言われるように、コントロールを取って、処理に問題がないかどうかを確認されることは必要になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1061-5 - 2008/04/30 (水) 09:33:41 - - 細胞の固定法によっては、蛋白の局在が変わってくることもあるのでその点は注意が必要です。 特に有機溶媒による固定はかなり激しいものなので、パラホルムアルデヒドで固定したものとの比較は常に必要と思います。目的の蛋白が膜蛋白ですと、Triton-X処理による影響は出てくるかもしれませんが、いずれにせよ名無しさんのおっしゃるように濃度をふってみるのがよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1061-4 - 2008/04/30 (水) 08:32:51 - 名無し すいません。少し追加します。ターゲットが細胞膜蛋白質ということなら、膜透過処理なしで一度行ってみたらどうでしょうか。界面活性剤による膜透過処理は基本的には細胞内蛋白質を調べたいときにそのままでは細胞膜が邪魔して抗体が中に入れないので行うものです。だから細胞膜蛋白質ならこの処理をしなくてもエピトープが抗体がアクセスできる位置なら染まる可能性があります。（あるいはこの処理で膜からとれてしまいなくなってしまうかもしれません）ターゲット蛋白質が細胞内か膜かはっきりさせるときに、界面活性剤処理ありなしでやることもあったとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1061-3 - 2008/04/30 (水) 08:17:50 - 細胞膜 ＞名無しさん 確かに自ら確認してみるのが得策ですね。triton-X 100のみでなくメタノールでも行ってみることにします。 お手を煩わせてすみません！！ ただ一般論としてtriton-X 100のような界面活性剤を高濃度で用いることは細胞膜タンパク質の局在にやはり影響が出てしまうのでしょうか？ 細胞の溶解等には1%程度で用いるのが普通のようですので・・・。

(無題) 削除/引用 No.1061-2 - 2008/04/29 (火) 22:42:16 - 名無し 大雑把に何点か濃度と時間を振って、結果を比べてみれば良いのではないかと思います。こういうのは使う細胞や抗体の種類でいろいろだと思うので。細胞撒いて3日もあれば答えが出ると思う。ラボマニュアルとかたしかに便利な事もあるけど、やっぱ自分の実験だからどうしても自分で条件決めていかないといけない部分は必ずある。あと冷メタノールなどの有機溶媒で低温(−20C~30Cくらい）で短時間の処理（数分）で固定すれば膜スカスカになるから界面活性剤による透過処理が不要になるとおもうのでもし余裕があれば一緒に試してみればどうでしょう。

膜透過性処理について 削除/引用 No.1061-1 - 2008/04/29 (火) 22:02:42 - 細胞膜 いつも参考にさせていただいています。 研究初心者の私としては本当に勉強になります。 最近、免疫染色法による細胞タンパク質の局在観察を始めました。 抗体で処理する前の膜透過性処理を私は、triton-X 100 を用いて行っているのですが、この界面活性剤の濃度が濃いと細胞の観察像に影響するでしょうか？ 文献等を調べたところ、通常0.1〜0.2%程度で行っているものが多かった印象を受けたのですが、私は研究室のメソッド上 0.5%で行っております。 ふと不安になったので質問させていただきました。 ご教授の程よろしくお願いします。

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