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(無題) 削除/引用 No.1063-12 - 2008/05/05 (月) 22:14:35 - A ちょっと一般的なやり方とは異なりますが以下のように AhdI制限酵素サイトを２つ入れたプライマーを設計して それを手持ちのベクターにライゲーションして環状の ベクターを作成、プレップします。プライマー設計が 肝で上手く設計できればこのベクターをAhdIで制限酵素 処理して直鎖DNAをゲルから切り出すだけで自作のT-Vectorが 出来あがります。 AhdI AhdI 5'--xxxGACNNTNNGTCxxx--xxxGACNNANNGTCxxx--3' 3'--xxxCTGNNANNCAGxxx--xxxCTGNNTNNCAGxxx--5' AhdIのような特性を持った他の制限酵素、例えばHpyCH4IIIなど も同様に利用できるはずです。メリットは一度コンストラクトが 出来上がればその後はT付加の効率をいちいち気にしなくとも 良いことです。

皆様、ありがとうございます 削除/引用 No.1063-11 - 2008/05/01 (木) 10:00:07 - mac 多くのアドバイスをいただきまして誠にありがとうございました。 大変勉強になり、また、皆様のご厚意に感動しております。 しっかりとゲル切りしたつもりですので、環状プラスミドの混入の可能性は限りなく少ないと考えています。 皆様のお話を聞く限り、Ｔ付加がうまくいっていないか、末端プライマーの配列等の影響でoverhang Aの付加がうまくいっていないか、のどちらかのような感じがしています。 ちなみに、私が使ったTaqはInvitrogenのrecombinant Taq DNA polです。 TdT活性があるとはマニュアルには書いてありませんが、、、ひょっとしてこのせい？？ コントロールをきっちりとって、再度挑戦しようと思います。

皆様、ありがとうございます 削除/引用 No.1063-10 - 2008/05/01 (木) 09:10:49 - mac 多くのアドバイスをいただきまして誠にありがとうございました。 大変勉強になり、また、皆様のご厚意に感動しております。 ゲル切りしたつもりですので、環状プラスミドの混入の可能性は限りなく少ないと考えています。 皆様のお話を聞く限り、Ｔ付加がうまくいっていないか、末端プライマーの配列等の影響でoverhang Aの付加がうまくいっていないか、のどちらかのような感じがしています。 ちなみに、私が使ったTaqはInvitrogenのrecombinant Taq DNA polです。 TdT活性があるとはマニュアルには書いてありませんが、、、ひょっとしてこのせい？？ コントロールをきっちりとって、再度挑戦しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1063-9 - 2008/04/30 (水) 11:55:49 - Pumpkin まず、みなさんが言われるようにすべての段階でコントロールをとられることを激しくお勧めします。私も自作Tベクタを使うことがありますが、いいものを作るには難しいように思えます。 �@完全消化は間違いないですか、それともEcoRVで消化後、線状プラスミドをゲル切り出しによる精製を行っていますか。環状プラスミドの混入はありませんか。 �ATaqはちゃんとワークするものですか？TdT活性があるTaqですか。 �BdTTP付加のあと、セルフライゲーションチェックを行っていますか。ここでのコロニー数がインサート：ベクタライゲーションした後の青コロニーの数と一緒であれば、環状プラスミドの混入かT付加の効率が悪いために平滑ライゲーション産物が多く出来ています。 �Cコントロールインサートによるチェックを行っていますか。以前にTベクタを購入していればコントロールインサートがあるはずです。また、研究室メンバーに白コロニーが得られたインサートをお持ちの方がいるはずです。 �Dインサートの長さやフレームの一致によって青がでることが知られており、実際結構遭遇することがあります。しかしながら、全てが均一の色（濃さ）だったり大きさだったりするばあいには経験的にはずれが多いです（ベクタの問題）。 面倒ですが、ベクタを脱リン酸化してインサートをリン酸する方法やTaqの代わりにTdTとddTTPでT付加する方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.1063-7 - 2008/04/30 (水) 10:48:24 - AP ＞白いコロニーが全然出てきません。 形質転換効率は何cfu/ugベクターでしょうか。 非常に高いようでしたら、プラスミドの切れのこりが多いとか、T付加が効率よくいっていなくて、セルフライゲーションが多かったという事になるでしょう。 形質転換効率は非常に低いけれど、かろうじて出てきたコロニーが青ばかりというのでしたら、それはバックグラウンドレベルの切れのこりやセルフライゲーションによるもので、ベクターのプレパレーションはまずまずだけれど、インサートの方に問題がある可能性があります。 一つの可能性として、インサートをゲル精製するときのUV照射による変成が疑われます。 いずれにせよ、ベクターのみでライゲーションなし（切れのこりがコロニーを生じる）、ライゲーションあり（前記プラスT付加されていないベクターのセルフライゲーションがコロニーを生じる）のコントロールをとって見てください。 これで非常に高いcfuなら、ベクター調製を改善する必要があります。 また、これらの形質転換効率が、インサートとライゲーションした場合と大差ない場合は、インサートの調製に問題がありそうです。

(無題) 削除/引用 No.1063-6 - 2008/04/30 (水) 10:08:49 - う〜んと 横から失礼します。 インサートなしでライゲーションしたネガティブコントロールはどうですか？ ネガコンで沢山コロニーができるようなら、ベクターの処理からやり直すべきなのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1063-5 - 2008/04/30 (水) 09:52:05 - おお > インサートが短いとb-gal活性がみられるというのは耳にするのですが、具体的にはどれくらいの長さが”短い”と考えられますか？ > 100-200bpsなら結構見られることはあると思います。ただ長さでなく立体的な構造上のものですから、長くなるほど構造的に可能性が低くなっていくとは思いますが、長いからといって否定できるとはいえません。フレームがあっていることが前提ですが。

(無題) 削除/引用 No.1063-4 - 2008/04/30 (水) 09:48:03 - おお http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/upload/upld0507/43.pdf A, Gの時よく一塩基付加がおこり、Cの時はA付加でなくGをつける傾向がある。 Tの時は1ベース削ってAをつけるんではなかったかと思いますが詳しく覚えていません。 A、Gの時もAをつける傾向にあるのですがほかの塩基がつくこともあるようです。

(無題) 削除/引用 No.1063-3 - 2008/04/30 (水) 02:56:23 - mac ＞おお様 貴重なアドバイス誠にありがとうございました。 大変参考になります。 インサートが短いとb-gal活性がみられるというのは耳にするのですが、具体的にはどれくらいの長さが”短い”と考えられますか？ 「Ｔの付加はプライマーの末端シーケンスに依存する」とのことですが、これはインサートのoverhang Aのことでしょうか？ あと、具体的には末端シーケンスについてはどう気をつければよいのでしょうか？ ライゲーション中にEcoRVを入れておくのは、good ideaですね。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.1063-2 - 2008/04/30 (水) 02:15:28 - おお まずだまされたと思って、5、6個クローンを取ってみてください。 プラスミドを精製してまずEcoRVできれるか、インサートが入っているか確認してください。 インサートが短い時は特にインフレームの場合betaーgalの活性が見られる場合があります。 非常によいトランスフォーメーションでEcoRVで切れるベクターがある時はdTTPの付加が不完全と思われます。 あとTの付加はプライマーの末端のシーケンスに依存しますので、まだ確認していないなら、一度確認した方がいいでしょう。 ライゲーション中かライゲーションのあとでEcoRVで処理するとdTTP付加されていないプラスミドのセルフライゲーションが防げますが、インサートにその認識配列がないことが条件です。

TA cloningの効率 削除/引用 No.1063-1 - 2008/04/30 (水) 00:13:59 - mac 自作T-vectorを用いてクローニングをしているのですが、ライゲーションがうまくいきません。 T-vectorはpBlueScriptをEcoRVで処理した後、Taq polymeraseとdTTPでインキュベーションし、overhang Tを付加しました。 （無敵のバイオテクニカルシリーズ・遺伝子工学実験ノート・下に書いてある通りにしました） インサートは、Taqで増やしたものをgel-purifyしたあと、ライゲーションに私用しています。 ライゲーションはNEBのT4 DNA ligaseを用いて室温３時間くらい反応させ、DH5aをトランスフォームさせて、blue/white color selectionしています。 白いコロニーが全然出てきません。 自作T-vectorで効率よくクローンを得るコツみたいなものを教えていただければ幸甚です。

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