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(無題) 削除/引用 No.1085-2 - 2008/05/06 (火) 14:40:52 - おお ケースバイケースだと思うので、順番とかはいろいろやってみる方がいいかと思います。抗体のエピトープぶいが、DNA結合部位とオーバーラップする時は抗体を先に加える方がいいでしょうし、構造的が加わる場合は、親和性によってどっちかに転ぶでしょうし、、、一般論はないと思います。 抗体は、1ugあれば1対1で反応すれば150kDaのタンパク1ugと結合できることになります。200ngぐらいでもターゲットに対して大過剰入っていると思えませんか?とにかく実験系の許容範囲内で最大量入れれば何とかなると思いますし、その結果次第で修正できると思います。

supershift assayについて 削除/引用 No.1085-1 - 2008/05/05 (月) 22:58:08 - M はじめてsupershift assayを行う者です。 通常のゲルシフト反応は、トータル20μlで、核タンパク2 μgと0.03 pmolでバンドを検出しています。 今後、抗体を使ったスーパーシフトか、バンドの消失かで、その因子であることを検証しようとしていますが、核タンパクに対する抗体の比率や、加える順番など、わからないことが多くて困っています。 論文を検索すると、抗体は1μgくらいで使ってあるものが多いですが、タンパク量が記載されていなかったりでよくわかりません。 ちなみに私が使用する核タンパクは1μl（2μg相当）、抗体は400 ng/μlくらいのもので、抗体を1μg相当使うとしたら2μl以上となり、volumeでかなり核タンパクを超過してしまいますが、大丈夫でしょうか？ また、タンパクと抗体を先に反応させる場合は、プローブ以外のbinding mixtureも加えた状態で行った方がよいのでしょうか？ まとまりがなくてすみませんが、わからないことばかりなので、どなたか教えてください。

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