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(無題) 削除/引用 No.1143-12 - 2008/06/09 (月) 12:21:50 - mn 長い間報告ができず申し訳ないです。 制限酵素処理（ベクター、インサート両方）がおかしかったみたいです。 pBluescriptをXho1で処理をすると約3Kbのバンドが検出するのですが、その上に切れ残りではないバンドも出てきて、制限酵素処理の時間を長くするとだんだん薄くなっていくのですが、完全には消えませんでした。 もう片方の制限酵素Hind3で処理をしてもそんな事態にはならなかったので、Xho1によるニックか、制限酵素の活性が下がっていることが理由に考えられました。 新しい制限酵素を使うと、青白選抜後の白の24コロニー中15コロニーにインサートが確認できました。 レポーターアッセイのために次のpGL3へのサブクローニングをしている途中ですが、報告のため一度書き込みさせていただきます。 助言をしてくださった皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1143-11 - 2008/05/19 (月) 18:46:46 - AP ＞そういう方法がありましたか…自分もなるべく短時間で切り出せるようにします。ありがとうございます。 切り出したDNAをクローニングに使うなら、「なるべく短時間」ではなく全く当てないのが正解です。 DNAを可視化するにはUVをあてざるを得ないのですが、位置決めに必要最小限な範囲にするようにゲルを切り離すとか、遮蔽するとかして、回収するDNAの大部分には全くあてないのがいいです。 切り出しのときは長波長を使うのがふつうですが、ランプの出力や波長特性（短波長側にかなり高い裾があるかもしれない）によるでしょうし、安全が保証されるわけではありません。 逆に、一部分だけ当てる方法なら、開き直って短波長でじっくり観察していいので、バンドが薄くて見づらいとか、短時間ですますのに大あわてすることがないので作業も楽です。 最近、UVではなくブラックライトのイルミネータが広まってきていますが、あれはいいですね。感度はUVと遜色ないし、作業中当てっぱなしにしても、形質転換効率が落ちません（比較したわけではないけれど、UVなら全くコロニーが出なくなるような当て方をしてもちゃんと出てくる）。

(無題) 削除/引用 No.1143-10 - 2008/05/19 (月) 13:11:14 - mn >流したレーンの端を切って染めて位置を確認して、残りのゲルから切り出すように言っています。 そういう方法がありましたか…自分もなるべく短時間で切り出せるようにします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1143-9 - 2008/05/16 (金) 22:09:36 - ~ > 一度遊びで、 > 2kbのバンドを切り出して、 > Xho1とHind3で切って、 > 1kbを切り出してみるとか、 間違えました。 制限酵素サイトは元々のものではなく、プライマー由来のものですね。

(無題) 削除/引用 No.1143-8 - 2008/05/16 (金) 22:08:23 - ~ >その後のUVは多く見積もっても30秒以内で終わらせました。 ものすごく長い時間当てていますね。 これでは十分に原因の候補の1つになると思います。 私のいるラボの学生さんには、2秒以内に終わらせるか(ランプをつけて、はじめの点滅だけで位置を確認して、電源OFFする)、 流したレーンの端を切って染めて位置を確認して、残りのゲルから切り出すように言っています。 >白コロニーからプラ注したものには現れませんでした 白コロニーでは、青コロニーと同じ位置にバンドが見えているのでしょうか？ 1.3kbの配列がその条件のコロニーPCRで増えることを示すことは、ポジコンが無いので無理でしょう。 せめてヌルベクターと同じ位置にバンドがあることは見ておく必要があります。 一度遊びで、 2kbのバンドを切り出して、 Xho1とHind3で切って、 1kbを切り出してみるとか、 2kbのバンドを切り出したらそのままTAクローニング (内側のプライマーでコロニーPCRでチェック) などもしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1143-7 - 2008/05/16 (金) 21:20:56 - mn >このフォーラムに同様の相談はこれまでも多くあり、mnさんへのアドバイスも同じ子との繰り返しになりそうですので、まず過去のディスカッションを見てください。 似たようなトピックをたてて申し訳ないです。一応過去のディスカッションはすべて読ませていただいています。 >切り出しの時、DNAをUV被爆から防ぐ工夫はしていましたか？ 過去の相談にもあったので、そこには気を使いました。電気泳動後のエチジウムブロマイドには１分、その後のUVは多く見積もっても30秒以内で終わらせました。 やはり、インサートの問題ですかね…なんとかがんばってみます。

(無題) 削除/引用 No.1143-6 - 2008/05/16 (金) 21:15:27 - mn >PCR産物が目的のものであることはダイレクトシークエンスなどで確認されているのでしょうか？ そこは確認していません。ゲノムDNAからほしい産物を含む約2.0kbを外側のプライマーで増幅したPCR産物を鋳型にして、目的の1Kbの産物を内側のプライマー（制限酵素サイト付き）で増幅させるという方法をとったので大丈夫だとは思ったのですが…一度確認してみます。 >はずれというのは目的外の配列を拾ったということでしょうか？ そうであれば、ゲノムDNAから増幅できたと思っていたのが、そのはずれの配列だったということはありませんかね。 M13プライマーを使用してインサートが入っていれば約1.3kbのところにバンドが出てくるはずなのですが、白コロニーからプラ注したものには現れませんでした。青コロニーも確認しましたが同様の結果でした。 >後、もしかしたらプロモーター配列が悪さをしているかもしれませんので、 余っているライゲーション済みのサンプルがあれば、 トランスフォーメーションして、室温でインキュベートしてみてはいかがでしょうか。 その可能性も確認しつつもう一度実験します。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1143-5 - 2008/05/16 (金) 17:21:32 - AP このフォーラムに同様の相談はこれまでも多くあり、mnさんへのアドバイスも同じ子との繰り返しになりそうですので、まず過去のディスカッションを見てください。 ベクター系、ライゲーション方法をかえても、ほとんどコロニーがでないという事ですので、PCR産物の問題の可能性が高いと思われます。切り出しの時、DNAをUV被爆から防ぐ工夫はしていましたか？

(無題) 削除/引用 No.1143-4 - 2008/05/16 (金) 16:59:58 - ~ PCR産物が目的のものであることはダイレクトシークエンスなどで確認されているのでしょうか？ >Xho1とHind3で制限酵素処理をしたベクターと産物でライゲーションもしました。こちらは青白選抜で白コロニーがいくつかできていましたが、すべて外れでした。 はずれというのは目的外の配列を拾ったということでしょうか？ そうであれば、ゲノムDNAから増幅できたと思っていたのが、そのはずれの配列だったということはありませんかね。 はずれが切れて、目的のフラグメントは切れないような制限酵素処理すれば、はずれの率を減らすことができます。 後、もしかしたらプロモーター配列が悪さをしているかもしれませんので、 余っているライゲーション済みのサンプルがあれば、 トランスフォーメーションして、室温でインキュベートしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1143-3 - 2008/05/16 (金) 16:44:21 - mn 返事ありがとうございます。 TOPOTAでは、通常のLB/Ampプレートを使用しているので、青白選抜はしていません。LB/Ampプレートでコロニーなしの状態です。 ちなみに流れはPCR産物を電気泳動し、ゲル切り出し精製後GoTaqDNApolymeraseでアデニンの突出反応（72℃、20分）、TOPOベクターとのライゲーションです。 pBluescriptでは青白比はかなり白が少ないです。脱リン酸化処理の方ではセルフライゲーションは起こらなかったのですが、Sal1での制限酵素処理では、数コロニーセルフライゲーションがあったのは確認しています。

(無題) 削除/引用 No.1143-2 - 2008/05/16 (金) 15:20:48 - Pumpkin TOPOTAもカラーセレクション出来るわけですが、ホワイトのみならずブルーコロニーも出なかったということでしょうか。3'→5'校正活性のないTaqでPCRしたのですよね。ライゲーションとうよりはトランスフォーメーションに問題があるような気がしますが。例えば、コントロールインサートでのコントロールはとりましたか。 pBluescriptとPCR産物を制限酵素処理してのライゲーションでは、コロニーが観察されるようですが、青/白比はどうですか。あまりに白が少ないとうまくいっていない可能性が大きいです。これも過去ログでクローニングについていろいろと指摘されているように、ひとつひとつコントロールを入れていく方が早道だと思います。例えば、ベクターのセルフライゲーションチェックをしていますか。

pBluescriptでの制限酵素処理について 削除/引用 No.1143-1 - 2008/05/16 (金) 14:55:44 - mn いつも参考にさせていただいてます。 レポーターアッセイを行うのにあたって、ゲノムDNAから目的のプロモーターを、制限酵素サイト付きのプライマーでPCRをして増幅を確認しました。 約1kbの産物なのでTOPOTAクローニングでクローニングしようとしたところ、形質転換後、LB/Ampプレートにコロニーはありませんでした。 何度してもコロニーができないので、pBluescriptSK(-)にクローニングするため、Xho1とHind3で制限酵素処理をしたベクターと産物でライゲーションもしました。こちらは青白選抜で白コロニーがいくつかできていましたが、すべて外れでした。 ベクターのリン酸化や制限酵素処理などでベクターのセルフライゲーションを防いでも、白コロニーにインサートが確認できません。 こういう場合形質転換効率の問題なのでしょうか？

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