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(無題) 削除/引用 No.1145-5 - 2008/05/17 (土) 09:10:51 - AP >クローニングしたい時は増幅後の時間が長いと末端がヘテロになってとれにくいらしいです。 >サーマルサイクラーにかけたまま最後のステップで４度のまま帰宅し >翌日に続きをやって回収したりしたときと、 >PCR終了後の直後に当日のうちにゲル回収などしたときで >劇的にcloningの効率が変わったことが数度あります。 あー、言われてみれば思い当たる節があります。 このフォーラムにも、PCR産物のクローニングのトラブルに関する相談がたびたび寄せられていますが、その点の指摘は見たことがなかったような。 案外、それで失敗していることも多いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1145-4 - 2008/05/17 (土) 07:37:54 - 通りすがり 他の方がおっしゃてるように短時間での保存なら１本鎖に対する活性が主なため 無視してもよいですが、 たとえばPyrobestのような3'->5'exonuclease活性が比較的強いものなどは、 サーマルサイクラーにかけたまま最後のステップで４度のまま帰宅し 翌日に続きをやって回収したりしたときと、 PCR終了後の直後に当日のうちにゲル回収などしたときで 劇的にcloningの効率が変わったことが数度あります。 他の同僚からも同様の経験談を聞いたことがあり、それ以降自分でも注意し 学生などにも禁止してるぐらいです。 そのため例え低温でも長時間放置するとPCR産物に 何かしら良くない影響はあたえているようです。 PolI型の酵素だと全くそのような経験はないのでalpha型の酵素でのみ起きるようです。

長さだけなら 削除/引用 No.1145-3 - 2008/05/16 (金) 22:55:51 - う〜んと 産物の長さを見たいだけなら問題ないと思いますけど、クローニングしたい時は増幅後の時間が長いと末端がヘテロになってとれにくいらしいです。 実際そんな気もします。

(無題) 削除/引用 No.1145-2 - 2008/05/16 (金) 22:25:48 - AP 「一本鎖特異的」3'->5'exonucleaseという理解でいいと思います。 だから、反応液の調整でもたもたしているとprimerが分解されるけれど、できあがった2本鎖PCR産物は分解されないと、 もしかすると、条件によってはT4 DNA polymeraseのように二本鎖を3'->5'で削り込む活性もあるのかもしれませんが、dNTPsが十分あれば削り込みが起こってもすぐ埋め戻されるので問題ないでしょう（プライマーの場合は埋め戻せないので削れる一方）。低温保存では伸長速度も落ちるでしょうが、Exo活性も落ちるでしょうし。

PCR酵素 削除/引用 No.1145-1 - 2008/05/16 (金) 21:25:24 - バンホーテン Pfu等の3'->5'exonuclease活性を持つＰＣＲ酵素について教えてください。これらの酵素は3'->5'exonucleaseを持つがゆえにＰＣＲ中に発生したmutationを校正することができますが、mixtureの調製時にプライマーを分解するケースもあると聞きます。ここで疑問に思ったのですが、PCR産物を分解してしまうことはないのでしょうか？そういう事例がありましたら、教えてください。私はPCR終了後に得られた産物をPCRtubeごと冷蔵保存することがよくあるのですが、このくらいは大丈夫ですよね？

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